ASDの性差の神経トランスクリプトーム解析
自閉症スペクトラムの性差の神経トランスクリプトーム解析。現在の知見と今後の方向性
リー・T・キセルら、Biol Psychiatry.2022.
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概要
自閉症スペクトラム障害（ASD）は、一貫して男性が女性の3～5倍の頻度で診断されており、この劇的な性差のある有病率は、リスクの調節に性差のある生物学的因子が関与していることを示唆している。ヒト脳組織のトランスクリプトーム解析は、性差とASDの影響を受けた神経生物学の交差点にある遺伝子と関連する機能的プロセスを同定するための偏りのないアプローチを提供することができる。近年、ASD脳における遺伝子発現の変化を特徴づけるいくつかの研究が、サンプルサイズと細胞解像度を上げて発表されている。これらの研究では、グリアや免疫機能に関連する遺伝子セットの発現上昇、ニューロンやシナプス機能に関連する遺伝子セットの発現低下など、ASD脳におけるデータセットや遺伝的に異質なサンプル間でいくつかの収束的パターンが報告されています。神経型大脳皮質組織の評価では、男性ではグリア・免疫関連遺伝子の発現が上昇し、女性ではニューロン関連遺伝子の発現が低下するという、性差による並行パターンが報告されており、性差によるASDリスク機構においてこれらの細胞タイプの役割が期待されます。しかし、ASD脳の既存研究では、ASD女性ドナーの数が限られており、顕著な性差の形態や機能を示すことが知られていない大脳皮質領域に主に焦点を当てているため、これらのメカニズムの検証やさらなる探求は、利用可能なデータからは困難である。本総説では、ASD脳のトランスクリプトームに関するいくつかの画期的な研究から得られた収束的な知見と、性差のある遺伝子発現との関係をまとめ、ASDにおける性差のトランスクリプトーム解析に関する限界と残された疑問について考察している。
キーワード自閉症スペクトラム、大脳皮質、遺伝子発現、性差、トランスクリプトミクス。
自閉症スペクトラム（ASD）は、広範な神経発達障害であり、現在、米国の小児の約54人に1人が罹患していると言われています（1）。ASDは、女性に比べて男性で3～5倍多く診断されており（1,2）、神経精神疾患の中で最も性差のある疾患の一つであると言われています。このような有病率の差にもかかわらず、ASDの臨床的表現型を男女で比較した大規模な研究では、女性では制限的行動や反復的行動が減少し（3、4、5、6）、社会的コミュニケーション特性に関する性差の影響が見られる（4、5）ものの、全体の重症度は男女間で同様である（3、4）ことが報告されている。ASDのリスクには、一般的な遺伝性変異（7,8）と稀なde novoの高悪性度変異（9,10）の両方が寄与していると言われています。FMR1（脆弱X症候群）（11）、MECP2（レット症候群）（12）、NLGN3、NLGN4X（13）など、いくつかのX染色体遺伝子座が関与しているが、既知のリスク変異の大部分は常染色体である（8, 9, 10）。CHD8、MBD5、SYNGAP1における稀なdeleterious variantsのASD症例における男性偏在など、いくつかの常染色体ASDリスク遺伝子は、ある性において優先的に発達障害と関連しているが（14）、そのメカニズムは十分に理解されていない。
組織や細胞における分子機能をゲノムスケールで近似的に読み取ることができるため、脳におけるトランスクリプトーム解析は、脳疾患の神経生物学的な探求に有用であり、遺伝子探索作業を補完する情報を提供することができる。適切な統計手法を適用すれば、ゲノムスケールでのトランスクリプトーム解析により、疾患に関与する生物学的プロセスを偏りなく発見でき、ゲノムスケールのデータセット間でバイオインフォマティクス的に比較し、収束点を特定することが容易になります。また、トランスクリプトーム解析は、特定の疾患や形質における性差の特徴づけにも応用でき、罹患した男性と女性の差や性差によるリスクメカニズムなどを明らかにすることができる。障害に対する性差のある病因や反応を示唆するような、障害状態の男女差を同定するには、十分な検出力を持ち、バランスのとれた患児男女のサンプルが必要です（図1A）。性差リスクの調査には、性差と障害生物学の両方に影響される遺伝子と関連する生物学的プロセスを特定するために、症例対照比較とベースラインの神経型性差の特徴を統合することが必要である（図1B）。
図1性差のトランスクリプトーム解析の研究デザインと成果。(A）障害状態における性差の特徴を明らかにするには、男性と女性の症例を比較する必要がある。(B）性差のあるリスクに関与する遺伝子やプロセスを同定するには、神経型の男性と女性の対照群、対照群と症例群の比較が必要である。(病態推定遺伝子は、障害状態や罹患頻度の高い性で発現が上昇することが予測される。(D）推定される保護遺伝子は、障害状態では発現が減少し、罹患頻度の低い性で発現が増加すると予測される。
このような遺伝子は、リスクに対する影響の方向性によってさらに分類することができる。障害のある状態、および障害の多い性（ASDでは男性）で高発現している遺伝子は、障害の病態の性差による脆弱性メカニズムに関与しているか、あるいはタグを付けている可能性が高い（図1C）。健康な状態およびASDに罹患している頻度が低い性（ASDでは女性）で高発現している遺伝子は、性差による保護機構に関与しているか、あるいはタグ付けされている可能性が高い（図1D）。ASDの性差リスクメカニズムを探るトランスクリプトーム研究の大きな目標は、男性の脆弱性の増幅や女性のリスクの低減に関与するこれらの遺伝子を見つけることである。
この目標を念頭に置き、本総説では、ASD脳組織のトランスクリプトームパターンに関する画期的な研究から得られた主要な結果を明らかにし、ASDに関連する変化が神経型の性差とどのように交差しているかを説明することを目的としている。また、これらのパターンが性差リスクメカニズムに与える影響、現在利用可能なデータセットの限界、そして今後の研究に残された疑問についても議論している。
ASD脳からのトランスクリプトームデータの利用可能性
これまでに、ASDと対照脳の組織や細胞におけるトランスクリプトームの違いを特徴づけるいくつかの画期的な研究が発表されている（15、16、17、18、19）。しかし、ASDドナーから入手できる脳組織はまばらであるため、これらの研究は限られたサンプルサイズに依存しており（表1）、初期の遺伝子発現研究（15）におけるわずか6人のASDドナーから、バルク脳組織トランスクリプトミクスに関する最新の報告（18）における48人のASDドナーの範囲にとどまっている。重要なことは、研究サンプルが完全に独立していないことである。これら5つの研究でアッセイされた組織は、合計で160人のユニークなドナーに由来するものであった。ASD69名、対照群91名である。これは、ASDの遺伝的・表現的不均質性に取り組むには比較的少ない数であり、CommonMind Consortiumが最近発表した353例を含む統合失調症など、他の精神神経疾患のトランスクリプトームデータ作成にも遅れをとっています(20)。組織の入手可能性から、両疾患の脳トランスクリプトーム研究は、最近のゲノムワイド関連研究では18,381例のASD（8）と36,989例の統合失調症（21）、希少変異解析では11,986例のASD（10）と3444例の統合失調症（22）の遺伝子解析と比較すると、制限されている。
表1ASD脳のトランスクリプトーム研究でアッセイされた組織ドナーと脳部位
各試験におけるドナー個体の総数およびアッセイされた脳部位を記載。
ACC、前帯状皮質；ASD、自閉症スペクトラム障害；BA、ブロドマン野；PFC、前頭前野；RNA-seq、RNAシークエンス；STG、上側頭回。
ASDの有病率が男性に偏っていることと同様に、すべてのデータセットが男性優位であり、ASDの全ドナー69名のうち、女性は14名のみである。適切に、すべての症例群と対照群は性別が一致しており、症例対照の状態と性別が交絡する可能性は低いが、解析に利用できる女性の脳トランスクリプトームの数は直接的に制限される。このように症例および対照となる女性からのデータが少ないことは、1）大うつ病性障害（23,24）や心的外傷後ストレス障害（25）で観察されているような男性と女性のASD症例間の発現パターンの差異、2）女性のASD脳が性特有の期待からいかに乖離しているかを明らかにするための女性の症例と対照間の差異、3）男女間でASDトランスクリプトームの変化が影響の大きさや方向性に違いがある、性-診断間効果について明らかにするための大きな課題となっています。
ASD脳におけるトランスクリプトーム変化
サンプル数は比較的少ないものの、バルク脳組織の研究により、ASD神経トランスクリプトームの変化を説明することに成功している。より一貫して観察されるパターンの一つは、アストロサイト、ミクログリア、免疫、および炎症機能に関連する遺伝子の発現の上昇であり、これはGarbettらによって初めて報告された(15)。Autism Tissue Program（現Autism BrainNet, www.autismbrainnet.org）のASD-対照群6組のマイクロアレイデータの差分発現解析により、ASD上側頭回では抗原特異的・細胞特異的免疫反応、炎症、自己免疫、免疫介在細胞死Gene Ontologyカテゴリーに富む遺伝子が発現上昇していることが明らかにされた。その後、マイクロアレイ（16）やRNAシークエンシング（17,18）を用いたバルク組織の大規模な研究により、遺伝子共発現ネットワーク（モジュール）の発見と機能アノテーションにより、このパターンが再現されている。特に、Voineaguら（16）は、アストロサイトとミクログリアの機能に関連する遺伝子に富み、ASD脳で対照群と比較して発現が増加している、M16とラベルされたモジュールを同定した。2014年のGuptaらの研究（17）では、より大きなサンプルと符号付きの共発現ネットワークを用いて、M16をアストロサイト関連（Mod7）と活性化ミクログリア関連（Mod5）の別々のモジュールに分解したが、ASD-発現上昇したMod5のみが多重検定補正後に有意であった。Parikshakらによる最新かつ最大の研究（18）では、ASDで有意に発現が上昇する3つのモジュールを特定し、そのうちの1つはアストロサイトマーカーに富み（CTX.M9）、もう1つはミクログリアマーカーに富む（CTX.M19）ことが明らかになり、このシグナルの分解能がさらに拡大された。
これらのグリア関与の推定される変化が、上流リスク曝露の二次的結果であるか、アストロサイトおよびミクログリアがASDの一次的な症状関連病理に関与しているかは不明である。ここで紹介したどの研究でも、ASDで上昇したグリア／免疫関連モジュールのいずれにおいても、希少または一般的な変異体を含むASD遺伝的リスク因子の濃縮は観察されず、これらの上昇した発現パターンを駆動する機能変化は、遺伝的リスク変異の直接的影響から下流にある可能性が高いことが示唆された。これらの変化が原因因子の下流か上流かにかかわらず、ASD症状の上流にある（そしてASD症状に寄与している）可能性は残っており、それは治療標的としてのグリア/免疫経路の有用性に影響を及ぼすと思われる。この可能性については、今後の実験的研究が必要である。
一括組織トランスクリプトーム解析では、ASD大脳皮質で一般的に発現が低下している神経細胞やシナプス機能に関連するモジュールも同定されている。Voineaguら（16）は、シナプス機能、小胞輸送、神経細胞投射に関連するASD制御の神経細胞モジュール（M12）を報告し、Guptaら（17）は、M12を、シナプス伝達機能に富む3つの符号付きモジュールに分解している。この3つのうち、Mod6はASDで有意に発現が上昇し、シナプス伝達と関連する抑制性イオンチャネル活性に関連することが判明したMod1遺伝子は有意に発現が低下していた。Parikshakら（18）はその後、M12モジュールとも重複し、神経細胞マーカーやシナプス遺伝子に富む3つのASD-downregulatedモジュール（CTX.M4, CTX.M10, CTX.M16）を特定し、これらの著者もCTX.M10とCTX.M16モジュールの主要機能として神経細胞の発射速度に関係していると述べている。
アップレギュレートされたグリア/免疫遺伝子とは対照的に、ダウンレギュレートされた神経/シナプス遺伝子はASD遺伝的リスクと重なる証拠を示し、これらの遺伝子の発現の変化がASDの原因ルーツに近い可能性を示唆する可能性がある。初期のASDゲノムワイド関連研究（26）から得られた共通バリアント関連シグナルの遺伝子セットの濃縮度を評価するために並べ替え検定を用い、Voineaguら（16）はM12遺伝子がASD共通バリアントリスクに有意な濃縮度を示すことを観察した。しかし、Guptaら（17）やParikshakら（18）の知見は、その初期の遺伝的リスクの濃縮を支持せず、代わりにASDで有意な発現変化を示さなかったモジュールでのみASDの希少バリアントリスク遺伝子の濃縮を見出し、ASDアップレギュレーションCTX.M20モジュールではASDゲノム全体関連研究シグナルの一般バリアント濃縮は弱いと判断した。これらの対照的な知見は、神経細胞に影響を与える上流の遺伝的リスクと下流の転写変化が、分離可能な遺伝子セットと機能に関与している可能性を示唆するものである。
ASD脳のバルク組織解析で報告されたその他の発現変化には、脳領域間の差異、異なる遺伝的病因の症例間の類似性、個人ドナー間の差異などがある。大脳皮質と小脳組織の両方を評価した研究（16,18）では、大脳皮質でより大きな発現変化が観察され、小脳に対して大脳皮質で有意なASD差発現遺伝子数（444対2遺伝子（16）、1142対0遺伝子（18））がかなり多く、ASDの転写変化に対する生後大脳の感受性がはるかに高いことを示している。前頭葉と側頭葉の組織を比較した発現差解析では、ASDでは領域ごとに異なる発現を示す遺伝子の数が減少しており［対照試料では510（16）遺伝子と551（18）遺伝子、ASD試料では8（16）遺伝子と51（18）遺伝子］、ASDでは皮質のパターンが明確ではなく、破綻している可能性があることが示唆された。15q11.2-13.1重複症候群（dup15q）患者9名のデータを特発性ASD症例からのサンプルと一緒に解析したところ、これら2つの症例グループのトランスクリプトーム変化には著しい類似性があり（18）、異種遺伝リスク暴露の下流で神経生物学的変化が収束することが示唆されました。しかし、個々のサンプルにおける発現変化は、グループ平均が示唆するよりも多様である。ASDドナーの組織は対照サンプルに比べ、神経細胞/シナプス系遺伝子の発現が相対的に低下し、グリア/免疫系遺伝子の発現が上昇する傾向があるが、これはすべてのASDサンプルに共通するものではない（図2）。また、女性サンプルも男性サンプルと同様のパターンを示すことから、これらの方向性のある発現変化は男性特異的なものではないようである。
図2側頭葉におけるASD関連遺伝子の共発現モジュール。側頭葉のサンプル（x軸）間のモジュール固有遺伝子値（y軸）の視覚化。各性別診断群内では、サンプルは年齢の昇順に表示されている。ASDで発現が増加したモジュール（CTX.M9、CTX.M19、CTX.M20）は左に、ASDで発現が減少したモジュール（CTX.M4、CTX.M10、CTX.M16）は右に示している（18）。ASD、自閉症スペクトラム障害、CTL、コントロール。
バルク組織解析で得られた発現量の異なる遺伝子は、特定の細胞型の機能に注釈を付けることができますが、バルク組織解析では、これらの発現変化の細胞由来を決定的に分離することはできませんし、細胞数の影響と細胞型固有の発現変化を決定的に区別することもできません。シングルセルのRNA配列解析は、これらの不明な点を解決するために始められる。Velmeshevら（19）は、ASD症例と4～22歳の対照被験者の前頭前野と前帯状皮質から単一核RNAシーケンスデータを作成し、ASDに関する最初のデータセットを発表した。同定された17の細胞型クラスターのうち、原形質性アストロサイトのみが対照被験者よりもASDに比較的多く存在することが判明し、細胞型構成の変化がASD脳組織に見られるグリア/免疫遺伝子発現上昇に寄与している可能性が示唆されました。さらに、各クラスター内で実行された細胞型特異的な発現差解析により、ASDで最も有意に上昇した遺伝子は原形質アストロサイトまたはミクログリアで主に観察され、ASDで最も有意に低下した遺伝子は皮質層2/3興奮性ニューロンおよび血管作動性腸ポリペプチド陽性介在ニューロンで主に観察されることが示された。また、本研究では、層4と層2/3の興奮性ニューロン、血管作動性腸ポリペプチドとソマトスタチン陽性の介在ニューロンにおいて、差次発現遺伝子のうち希少なバリアント関連ASDリスク遺伝子が予想以上に濃縮されていることが報告された。同様に、扁桃体における独立した解析（27）では、扁桃体介在ニューロンにおけるASDリスク遺伝子のダウンレギュレーションが報告されたが、扁桃体のミクログリアやアストロサイトにおけるASD関連遺伝子のアップレギュレーションは観察されず、このパターンは領域特異的である可能性が示唆された。これらの初期の知見は有望であり、今後、より多くの個人ドナーや幅広い脳領域からのデータ作成により、細胞レベルでASDを特徴づける分子の変化や、それらが遺伝的感受性や全体のASD病態とどのように関連しているのかについて、貴重な知見が得られると思われる。
神経型性差発現がASDと対照の差に関係すること
対照サンプルと比較したASD脳組織のトランスクリプトーム変化は、障害状態に関連した変化を定義し、ASDの性差リスクメカニズムを解明するためには、これらの障害関連パターンが神経型性差とどのように交差し、または相互作用するかを理解する必要がある（図1B）。2016年の研究（28）では、神経型大脳皮質組織からの一連の性差発現解析の結果を、ASDに関連する遺伝子発現変化やリスク遺伝子と比較することで、この疑問に直接対処している。具体的には、Werlingらは線形混合効果モデルを適用して、3つのデータセットにおける性差発現の特徴を明らかにした：BrainSpanからの13-40歳の男性5人と女性5人のドナーの58個の皮質サンプルからなる成人の発見データセット、妊娠後16-22週の男性4人と女性4人のドナーの86個の皮質サンプルによる出生前データセット、16-56歳の男性と女性の5人のドナーの13個の皮質サンプルによる成人再現データセットである。
当時定義されたASD上昇型グリア・免疫モジュール（M16とMod5）（16,17）のいずれかに属する遺伝子は、成人の発見データと出生前データセットの両方で、女性偏重よりも男性偏重の発現を示す傾向が著しく、M16遺伝子は成人の複製データでも著しく男性偏重であった。成体および出生前の大脳皮質における男性に偏った遺伝子は、複数のソースで定義されたアストロサイトおよびミクログリアマーカー遺伝子にも有意な濃縮を示した(29,30)。逆に、ASDで制御される神経／シナプスモジュール（M12、Mod1）に属する遺伝子は、成体発見データでは女性に偏った発現が有意に多かったが、このパターンは出生前や成体の複製セットでは観察されなかった。ASDリスク遺伝子は、SFARI (Simons Foundation Autism Research Initiative) Gene database (https://gene.sfari.org/) (31) からの候補遺伝子や、ASD症例において稀にde novo protein-truncating or missense variants (32) を持つ遺伝子を含むが、どのデータセットにおいても性差発現が強調されず、ASDの性差的有病率の駆動メカニズムは遺伝リスク変異から大きく下流で作動するというワーキングモデルとも一致している (28)（Philippine 2004）。
その後、BrainSpanデータセットの時空間的範囲における神経型性差発現の解析では、受胎後8週から40歳までの40人のドナー（男性23人、女性17人）から得た594個のサンプルを取り込んだ（33）。Parikshakら(18)が報告した6つのASD調節モジュールの大脳皮質組織における性差のある発現パターンを発達時間にわたって評価したところ、事前の観察を裏付ける結果となった。すべてのニューロン関連モジュールは発達にわたってほぼ性差のない発現を示し、アストロサイトおよびミクログリア関連モジュールでは胎児発達中期から後期に男性偏向発現、CTX.M9ではさらに成人期に男性偏向の発現を示している（図3）。CTX.M9で男性に偏る顕著なアストロサイト関連遺伝子には、APOE、ホルモンに対する神経反応に関連するRERGやSLCO1C1などの遺伝子が含まれている。CTX.M19はミクログリア機能に富んでおり、CTX.M19の男性に偏った遺伝子には、LYN、B2M、RHBDF2があり、これらは免疫細胞のシグナルとプロセスの制御と反応に関与している。出生前の性差についてさらに言及すると、120人の第2期のヒトドナーからの全脳におけるトランスクリプトームパターンを特徴付ける研究でも、性差のある発現を持つ2756個の遺伝子が発見された(34)。上記のBrainSpanの知見とは対照的に、これらの発現差遺伝子は、高信頼度のASDリスク遺伝子に有意な濃縮を示したが、性影響の方向は男性バイアス7、女性バイアス5のリスク遺伝子と分かれた。
図3ASDで制御されるモジュール遺伝子の発育時間による性差発現。Parikshakら(18)が同定した6つのASD-dysregulatedモジュール（上）またはupregulatedモジュール（下）に属するタンパク質コード遺伝子について、BrainSpanリソース（33）の前頭および側頭新皮質サンプルで観測された平均log2倍差（黒実線）が、8つの発達ウィンドウごとに表示されている（グレー破線垂直線）。赤青網掛けは、各遺伝子セットの平均log2 fold differenceの99%信頼区間を表示する。また、各モジュールの性差発現の後ろに、前頭葉および側頭葉皮質サンプルで発現した全17,222個のタンパク質コード遺伝子のlog2 fold differenceの中央値および四分位範囲を灰色で表示している。ASD、自閉症スペクトラム障害、FD、フォールドディファレンス、Fem、女性。
大脳皮質組織で見られるこれらのASDと性差のある発現パターンは、神経型男性（女性との比較）とASD（対照との比較）における神経生物学的特徴の並行シフトの存在を示唆している。アストロサイト／ミクログリア／免疫系遺伝子の男性偏重発現は、ASDで上昇した発現とは別であり、ASDで低下した神経／シナプス系遺伝子はデータセット間で様々に女性に偏っていることが一貫して観察された。いずれの機能カテゴリーにおいても、より頻繁に発症する性（男性）の神経型組織は、女性よりもASDに転写的に近く、グリア/免疫および/またはニューロンの生物学が性差リスクメカニズムに関与している可能性が示唆された。ASD対コントロールの効果の方向性から、グリア機能および/または細胞数の増加はASD病態に関連し、ニューロン機能または細胞数の維持または相対的な上昇は保護的であると仮定する（図1C、D）。細胞タイプの構成や分子機能がバルク組織に見られる性差にどのように寄与しているかを明らかにするには、より広範なシングルセル・トランスクリプトミクスを含むさらなる研究が必要であり、これらの細胞タイプが関わる推定上の病態生理および保護機構を調べるには神経生物学的実験が必要であろう。重要なことは、ASDの遺伝的リスクに関連する遺伝子が大脳皮質組織で性差なく発現していることから、少なくとも大脳皮質では、性差のあるリスク調節機構がリスク遺伝子発現の上流調節因子としてではなく、遺伝的リスク因子の下流に作用していることが示唆されたことである(28)。ASDのような遺伝的に異質な疾患では、下流の病態を標的とした介入により、多様な遺伝的病因の患者の症状を調節できる可能性が示唆され、希望が持てる観察結果である。
結論、限界、今後の方向性
ここでレビューした研究は、ASDの神経生物学と性差リスクメカニズムに関する洞察を提供するが、これらの知見は、性、年齢、脳領域、細胞タイプなど多次元にわたるサンプル入手可能性によって制限される。現在、主要なトランスクリプトーム研究において14人の女性ASDドナーのデータしか得られていないため、発症した男性と女性の性差を特徴付けること、性別をマッチさせた標準からの女性特有のシフトをアッセイすること、性別とASDの相互作用を特定することが著しく妨げられている。
また、このような特徴づけの努力は、年齢によってさらに複雑になる。ASDは神経発達障害でありながら生涯続く疾患であるため、ASD脳における遺伝子発現の変化は、発達の過程で静的なものではありません。性差生物学も同様にダイナミックで、初期の性分化、思春期、更年期を含む定義された段階を経て展開し、変化していく。ASDの性差リスクと神経病理を徹底的に理解するためには、これら2つの発達的に動くターゲットの相互作用を理解することが必要である。発達初期に関しては、神経型と思われるヒト組織からのトランスクリプトームデータは、ASDリスク遺伝子も強く発現・共発現する時期である胎児期が比較的多く利用できる（35,36）。しかし、胎児後期や幼児期のヒト組織サンプルは少なく、出生前の推定ASD組織へのアクセスには、すでに稀な疾患に対する胎児遺伝子診断が必要となる。ここで紹介したASD研究サンプル（表1）やBrainSpan（33）やBrainVar（37）のような発達に焦点を当てたデータセットには思春期にわたるサンプルが含まれているが、いずれもドナーの思春期に関する表現型情報がなく、この段階で十分に検出力のある比較をするには男女の数が不足している。成人期はGenotype-Tissue Expression（GTEx）プロジェクト（38）などの大規模データセットで十分カバーされているが、後者は高齢者に偏っており、含まれる女性の大半は閉経前後であると思われる。神経系組織では、男女比はGTExで約2.5：1、BrainSpanで1.3：1、BrainVarで1.4：1、出生後サンプルで2.4：1である。
ASD脳の既存のトランスクリプトームデータも地域的に限られており、主に大脳皮質と小脳に焦点が当てられています。ASDリスク遺伝子は大脳皮質組織（35,36）や皮質ニューロン（10）で強く発現しており、ASD（15, 16, 17, 18, 19）や神経型男性（28）の皮質ではトランスクリプトーム変化が明らかだが、多くの皮質下脳領域ではASD関連変化がまだ特徴づけられていない。したがって、ASDの病因と性差生物学が大脳皮質で直接相互作用するのか、あるいは他の脳領域が性差リスク機構においてより大きな役割を担っているのかは不明である。神経内分泌学や神経行動学の豊富な研究により、視床下部や線条体終末核などの皮質下の脳領域における細胞的・形態的性差が詳細に報告されている(39)。これらの皮質下領域もASD関連病理に直接かつ強固に関与している可能性があり、あるいは性差領域とASD罹患領域を物理的につなぐ神経回路を介してASDリスクを調節している可能性もある。しかし、これらの領域のバルク組織トランスクリプトームは、その解剖学的複雑さ（例えば、複数の小さく機能的に異なる視床下部核）のために、これまでほとんど優先されてきませんでした。現在では、単一細胞および空間トランスクリプトーム技術により、これらの困難な領域の特性解析が容易になりつつあり（40）、ASDの性差リスクへの関与を明らかにする、あるいは排除するために応用することが可能である。皮質下領域であれ皮質であれ、シングルセル解析は、ASD病理学や性差生物学に直接関与する細胞タイプおよび/または細胞状態、そしてこれらの細胞タイプが表現型に寄与する可能性の高いメカニズムをより明確にするために不可欠であろう。すでに、大脳皮質の単一細胞トランスクリプトームデータから、ASD関連遺伝子発現パターンにおいて、細胞型構成と細胞型特異的変化の両方が関与する可能性が示唆されているが（19）、これらの知見を検証し改良するには、さらなるデータ生成が必要である。
今後、in vivoおよびin vitroのモデルシステムは、ASDに関連する遺伝的変異のトランスクリプトーム、機能、行動への影響を、男女ともに、正確に選択された発生段階において、また複数の脳領域で探索するための重要なツールとなるであろう。ヒトの大脳皮質と同様に、Chd8、Arid1b、Shank3b、16p11.2欠損などのASDリスク遺伝子座のいくつかのマウスモデルにおいて、軸索誘導やグルタミン酸神経伝達の神経機能に関連する遺伝子モジュールの転写産物が減少していることが判明した（41, 42, 43）。また、ASDリスク遺伝子の筆頭であるChd8のヘテロ接合型変異体では、他の既知のASDリスク遺伝子の発現が一貫して低下しており（43、44、45）、ある研究ではChd8+/-変異体で発現が上昇した遺伝子に免疫反応関連、ASD上昇遺伝子が濃縮されており（44）、また別の研究ではChd8+/-制御低下遺伝子にASD制御下、ニューロン関連遺伝子が濃縮されていた（45）。これらのパターンは、ヒトの脳で報告された変化を部分的に検証するものであり、特定の遺伝的リスク変異をより広範な下流のトランスクリプトーム結果と関連付けるための非ヒトモデルの可能性を示すものである。しかし、これらの研究は、これまでのところ、性差とは無関係の障害に関連した変化に焦点を当てており、今後の解析で直接取り上げられる必要がある。また、動物実験では、グリア遺伝子の発現上昇がASD病理の原因であるのか結果であるのか、まだ明らかにされていない。共発現ネットワークの変化の中心となる「ハブ遺伝子」を破壊する実験や、これらのモジュールに関連する特定の細胞タイプの機能を標的とする実験がさらに進めば、グリア機能の増加（あるいはニューロン機能の低下）が、脳機能や行動における表現型の変化に寄与しているか、あるいは単に相関しているかを明らかにするのに役立つだろう。
ASD患者サンプル由来のヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）は、ヒト細胞であること、脳組織よりも入手しやすいこと、ごく初期の発生段階をモデル化できることなど、明確な利点があり、有用なモデルの一つである。興奮性・抑制性ニューロンに分化したhiPSCのトランスクリプトーム解析から得られた知見は、死後の脳組織と同様、ニューロン分化、ニューロン突起の発達とパターン形成、シナプスシグナルに関わる遺伝子ネットワークの調節障害などである(46,47)。しかし、現在のところ、hiPSCから誘導できる神経細胞の種類は限られており、性ステロイドホルモンを適用した場合としない場合のいずれにおいても、細胞培養系で性差生物学のどの次元を再現できるかはまだわかっていない。アストロサイトやミクログリア・ニューロンの共培養に必要な実験条件や、性差を適切にモデル化するための条件を探ることで、この分野の実験研究におけるhiPSCの有用性を前進させることができると考えています。
ヒトの研究からモデルシステムまで、ASDの女性サンプルは限られており、生物学的変数としての性への注目も限られているため、ASDの病態やリスクにおける性差を記述し理解することが妨げられてきた。ASDの障害状態や一般集団における性差をさらに明らかにすることは、ASDや性差のある有病率や症状を示す他の精神・神経疾患にとって重要であり、メカニズムを明らかにする実験的研究の舞台をより良く整えることになる。この目標に向けて、我々は個々の研究室、研究助成機関、ジャーナルが、すべてのヒトおよびモデル研究で女性のサンプルを含めることを促進または強制し、性差のある疾患であっても、可能な限り性差のないサンプルセットの分析を推し進めることを推奨している。障害の状態やリスクにおける性差を理解することは、障害の病理学の基本的側面を明らかにし、男女両方の患者に利益をもたらす治療法を設計する上で大きな可能性を持っているからである。
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