レット症候群の病態と発症メカニズム - 発達障害論文紹介ブログ

レット症候群の病態と発症メカニズムにおけるDNAメチルCpG結合蛋白質MeCP2の役割

Shervin Pejhan、Mojgan Rastegar

追加記事情報

概要

レット症候群（RTT）は、神経学的退行と自閉症スペクトラムの特徴を示す、重篤で稀な進行性の発達障害である。患者は主に若い女性で、95％以上の患者がMethyl-CpG-Binding Protein 2（MECP2）遺伝子にde novo変異を有している。RTT患者の大半はMECP2遺伝子に変異を有するが（古典的RTT）、ごく一部の患者（非典型RTT）は、サイクリン依存性キナーゼ様5（CDKL5）やFOXG1など他の遺伝子に遺伝子変異を有している場合がある。RTTの症状の神経学的基盤のため、MeCP2の機能はもともと神経細胞（ニューロン）で研究されていました。しかし、その後の研究により、グリアを含む脳の他の種類の細胞におけるMeCP2の重要性が浮き彫りにされた。この点で、多くの異なる細胞系や機能欠損あるいは機能獲得変異を導入したトランスジェニックマウスを用いた疾患モデル化が科学者にとって有益であった。さらに、ヒトの死後脳組織を用いた限られた研究によって、RTTの病理生物学と疾病メカニズムに関する貴重な知見が得られた。MeCP2の脳内での発現は厳密に制御されており、その発現の変化は脳機能の異常につながり、自閉症スペクトラム障害のいくつかの症例にMeCP2が関与していることが示唆されている。ある種の疾患では、MeCP2のホメオスタシス制御が損なわれており、その制御には、ネズミでは制御性マイクロRNA（miR132）と脳由来神経栄養因子（BDNF）が関与していることが分かっています。ここでは、RTTの病態生理とともに、RTTと関連するMECP2遺伝子の遺伝子変異、最も研究されている2つのタンパク質変異体（MeCP2E1およびMeCP2E2アイソフォーム）の役割、BDNFやmiR132など脳内のMeCP2恒常性ネットワークを制御する制御機構に関する最近の理解の進展について概説する。

キーワード：エピジェネティクス、DNAメチル化、MeCP2アイソフォーム、MeCP2E1、MeCP2E2、BDNF、miR132、脳発達、レット症候群、RTT病態生理

1.レット症候群の紹介

レット症候群（RTT）は、女性の神経疾患で、一般的に1-2歳までに女性の乳児に診断されます。主に脳の発達に影響を与え、成長とともに症状が進行していく病気です。多くの場合、出生時および生後6カ月までは正常と思われますが、その後、この病気の特異的な症状が現れ始めます。RTTの患者様は、幅広い神経学的障害や発達障害を示し、生涯を通じて継続的なケアが必要となります。RTTは一般にメチルCpG結合蛋白2（MECP2）遺伝子の変異による単発性疾患と考えられているが、ごく一部の症例では、他の遺伝子の変異が関連しているものもある。この総説では、主にMECP2遺伝子変異によるRTT症候群を取り上げる。その内容は、疾患の歴史、RTT患者の臨床的特徴、エピジェネティック因子としてのMeCP2、MeCP2変異とホメオスタシス調節、BDNF-miR132に焦点を当てたMeCP2標的および関連するシグナル伝達経路、さらに疾患の病理生物学に及んでいる。

2.レット症候群の歴史

今から半世紀以上前の1954年、オーストリアの小児科医であったアンドレアス・レット博士は、彼のクリニックで診察を待っていた2人の少女が、同じように曲がりくねった手の動きをしていることに気づきました。この2人の患者さんの臨床歴や発達歴も似ていた。さらに調査を進めると、レッツ博士は同じ障害を持つ少女を自分の診療所で6人、ヨーロッパ各地を旅行した際に22人の患者を発見した。診療所の待合室での目を見張るような偶然の一致から12年後、レット博士はドイツの医学文献にこの臨床例を報告した[1]。その17年後、スウェーデンの神経学者ベングト・ハーグベリ博士が同僚と共同で、この症候群をレット博士の名前とした。1983年にHagberg博士が報告した35例のRTTの英文報告により、医学界はRett症候群を認知するようになりました[2]。1992年、英国エディンバーグ大学のAdrian Bird博士とそのチームによって、MECP2遺伝子が初めて報告された[3]。その7年後、Huda Zoghbi博士らによって、MECP2変異がRTT病態の根本原因であることが発見された。彼らは、MECP2遺伝子の変異がRTT症例の大部分（90％以上）の原因であることを示しました[4]。RTTの遺伝的基盤が判明した直後の2001年に、RTTの最初の動物モデルが利用できるようになりました[5]。それ以来、いくつかのグループがこの疾患の病態生理の解明に取り組み、治療目的の臨床試験を行ってきました[6]。

3.RTTの臨床的特徴、診断、および病理組織学的特徴

レット症候群は、年齢とともに進行する神経発達障害であり、主に女性に見られます（女性の出生数10,000人に1人）[7]。古典的RTTはMECP2変異によるもので、比較的特徴がはっきりしていますが、非典型的RTTは発作の早期発症と発達の遅れが特徴です。非定型RTTは、サイクリン依存性キナーゼ様5（CDKL5）やFOXG1など、他の遺伝子に遺伝子変異を有する患者にも見られることがあります[8,9]。古典的RTTでは、神経発達の進行は最初の6ヶ月から18ヶ月は正常と思われるが、筋緊張低下や頭部成長の減速などの微妙な症状は通常生後早期に存在するが、しばしば無視される。運動機能の発達の遅れ、停滞、後退は、患者が医療機関を受診する最も頻度の高い訴えの一つである。一般的な成長の遅れ、体重減少、筋緊張低下による弱い姿勢も、この段階での一般的な所見である [10,11] 。

RTTが進行すると、目的を持って手を使う代わりに、定型的な手を絞る動作や洗う動作が見られるようになります。上肢の協調運動の欠如を伴う異常歩行や、社会的引きこもり、言語コミュニケーションの喪失も、RTT患者によく見られる症状である。環境刺激に対する反応の悪さなどの自閉的特徴は、成長するにつれて目立たなくなり、精神遅滞の徴候に取って代わられる [7]。RTT患者は呼吸異常（例：息止め、過呼吸、無呼吸） [12] 、不整脈（QT延長症候群） [13] 、胃腸機能障害 [14] などの自律神経障害も患っている。

RTTでは、コントロールしやすいてんかんから難治性のてんかんまでの発作がよく見られ、80％以上の症例で見られる可能性があります[15]。発作の発症年齢はMECP2遺伝子変異の種類に依存し、その重症度は10代以降、成人期にかけて低下する傾向がある[15]。運動失調（筋肉運動の総体的な協調性の欠如）や歩行失行（学習した動作ができない）を伴い、精神的な障害となる。運動機能障害により、RTT患者は10代から成人期にかけて車椅子に縛られることになる。臨床症状にはパーキンソン様の特徴が加わることもあります。RTT患者の側弯症や骨減少症などの骨格の変形は、運動機能の障害と座りっぱなしの状態が原因の一つである。筋緊張の低下もまた、このプロセスに関与している可能性がある [14] 。身体状態が悪いにもかかわらず、RTT患者は一般的に成人期（70％が45歳まで）、さらには70歳まで生存する。心肺機能の低下は、RTTの主な死因である [16] 。RTTの3つの主な非定型形態は、よく維持された言語不規則性、早期発症の発作、および先天性変種である [7,17]。

RTTの肉眼的および顕微鏡的特徴

レット症候群の肉眼的病理所見では、小頭症が主な所見である。RTT患者は出生時には正常な頭囲を示すが、2-3ヶ月後に頭囲の減少を示すようになる。脳重量の減少は普遍的なものではなく、大脳半球は小脳と比較して、また非RTT状態と比較して相対的に小さくなる [18]．神経画像では前頭前野、前頭後野、側頭前野の脳領域は体積が小さく、側頭後野、後頭後野は比較的保たれている [19,20]．一般に、RTTの脳の顕微鏡的評価では、変性、脱髄、または重大な奇形的過程は認められていない。大脳皮質のシナプス密度は低く、樹状突起の複雑さも減少している。中脳と黒質におけるメラニンやチロシン水酸化酵素の染色性の低下、淡蒼球のニューロンにおける輪郭や付属器の変化は、RTT症候群における脳の他の領域での所見の例である [22,23]．迷走神経の機能的研究で発見された迷走神経緊張異常は、RTTの自律神経障害と一致します。サブスタンスPは、神経伝達物質および神経調節物質として作用する神経ペプチドで、末梢神経系における痛み刺激の伝達における役割が最もよく報告されているが、中枢神経系における神経細胞の生存と同様に行動反応に関与している [24]．レット症候群患者の痛みに対する感受性の変化は、サブスタンスPの異常と関連している可能性がある。また、痛みの知覚におけるMeCP2の役割を示唆する研究もある[25,26,27]。

4.レット症候群の遺伝的基盤。遺伝子型と表現型の関連性

RTTはX-連鎖性疾患で、主に女性に発症するが、3つのグループの男性患者にも見られることがある。最初のグループの患者は、女性に典型的なRTTを引き起こす突然変異を持つが、これらの男児は重度の新生児脳症と1年未満の寿命を持ち、一般に小児期に早期に死亡する。X染色体異数性（Klinefelter症候群；47 XXY）や体細胞モザイクの希釈効果により、非定型RTTに似た軽度の表現型となることがある[28,29]。第二のグループは、女性患者の典型的/古典的な変異とは異なるが、成人期までの生活に適合した変異を示す。最後のグループは、CDKL5やFOXG1などMECP2以外の遺伝子に変異があり、男性でRTTに似た症状を示すものである[30]。

X染色体（Xq28）に位置するMECP2遺伝子のde novo変異は、定型RTTの95％、非定型RTTの半分以上の症例の原因である[31]。一般に、このようなde novo突然変異の大部分は父親の生殖細胞系で起こり[32,33]、RTTが女性優位であることを部分的に説明している。レット症候群のまれな家族例では、X染色体不活性化（XCI）の母親の偏りにより、同じMECP2遺伝子変異が無症状の女性キャリアからその子供へ受け継がれる可能性がある[34]。X染色体が1つしかないため、ほとんどの男性は乳児脳症などの重篤な症状を呈し、幼少期に死亡する[34]。MECP2遺伝子の4600以上の変異が同定されており、70%以上がRTTと関連している。しかし、そのすべてについてMECP2変異の原因的な役割は示されていない。これらの変異のうち、メチルCpG結合ドメインの3つの変異（R106W、R133C、T158M）、介在ドメイン（ID）の1つの変異（R168X）、転写抑制ドメインの4つの変異（R255X、R270X、R306C、R294X）、計8つが全変異の約47％を占める（図1）。同定されたRTT関連MECP2変異のいくつかは、MeCP2タンパク質の安定性に影響を与え、それが部分的に疾患生物学に関与している可能性がある[35,36,37]。示されたように、他の2つの遺伝子、FOXG1およびCDKL5の変異は、RTTの非定型型を引き起こす可能性がある[38]。

図1 f:id:inatti17:20220108132100j:image
図1
MeCP2タンパク質のドメインを模式的に表したもの。MeCP2タンパク質のドメインを簡略化して示したもの。図面はノンスケールである。最も多い変異の一つである主な点変異を示した。各ドメインの名称は...
RTT患者は、軽症から超重症まで、高い範囲の症状のバリエーションを示す。RTTを古典型と非典型型に分けることで、それぞれのカテゴリー内での差は小さくなりましたが、各グループ内、また一人の患者さんでも経時的に表現型にばらつきがあることが分かっています。X染色体の不活性化は、表現型のばらつきの主な要因の1つであることが示唆されている [39]。ほとんどの典型的なRTT患者は脳内でバランスのとれたXCIパターンを示すが [40]、非ランダムなXCIも報告されている [41]。体細胞モザイクは、表現型可変性のもう一つの潜在的な原因である [42]。最後に、特定のタイプのMECP2変異は、タンパク質機能に異なる影響を与え、表現型の異なる重症度につながる可能性もある。例えば、T158M変異（MeCP2のメチルCpG結合ドメインに影響）による重度のRTTは、メチル化DNAへのMeCP2の結合が妨げられ、その標的遺伝子の転写制御が変化するためと考えられる［43，44］、一方、C末端欠損はより軽い表現型と関連するかも知れない［45］。

4.1.N末端ドメインの変異

RTT患者に見られる数百のMECP2変異のうち、エクソン1を標的とするものは1％未満であり、MeCP2E1の機能不全はレット症候群を引き起こすのに十分であることを意味する[46,47,48]。MeCP2E2特異的な変異はRTTでは報告されていないが、MeCP2E2の発現によりMecp2ヌルマウスのRTT表現型のいくつかを改善することができることが示されている。本研究では、アイソフォーム特異的MeCP2トランスジェニック系統を用い、Mecp2-nullマウス（Mecp2-/Y）が示す神経表現型の救済を行った[49]。MeCP2の両アイソフォームに共通するN末端ドメイン（NTD）領域に影響を及ぼす変異が、RTT患者で報告されている[38]。

4.2.メチルCpG結合ドメインにおける変異

MeCP2メチルCpG結合ドメイン（MBD）領域内のThr158、Arg133、Pro152は、RTT関連変異の3つの共通点である。タンパク質のMBD領域に位置するT158Mは、RTTを引き起こす可能性のある最も頻度の高い変異です（約9％）。MBD領域からのR133CとR106Wは、RTTを引き起こす変異のリストの中で7位と10位にランクされています[38]。

4.3.介在ドメインにおける変異

介在ドメインは、MBDと転写抑制ドメイン（TRD）をつなぐ領域で、RTT患者で2番目に多いトランケーション変異であるR168Xが存在する場所である[38]。R190HやR190CのようなMeCP2のID領域におけるいくつかの変異もまた、統合失調症と関連している[50,51]。私たちの最近の研究では、RTT脳サンプルの1つにA201V変異が認められました。これはRTT患者の0.61%に見られる21番目に多いMECP2突然変異である。しかし、この変異が本症の原因となっているのか、それともRTTに関連して見つかった単なる多型なのかは不明である[38]。

4.4.転写抑制ドメインにおける変異

TRDはco-repressorであるSin3a、ヒストン脱アセチル化酵素（HDAC）[52]、NCoR/SMRT co-repressor[53]などのパートナータンパク質と結合する。R168X (IDより) に続く3つの最も一般的な切断型変異であるR255X, R270X, R294XはTRD内に位置している。さらに、T158M（MBD由来）に次いで多いミスセンス変異であるR306Cは、TRD内に位置している[38]。R306C変異のために、MeCP2はNCoR/SMRTとの相互作用を失っている[53]。

4.5.C末端ドメインの変異

MeCP2のC-terminalドメイン（CTD）は、ヒストンとの結合に関与している可能性がある[54]。また、このドメインにはS421というセリン残基があり、神経活動中にリン酸化され[55]、脳由来神経栄養因子（Bdnf）の転写活性化を引き起こす[56]。L386fsは、RTT患者に最も多く見られるフレームシフト変異であり、CTDに位置している。また、RTTに関連する6番目に多い置換であるE397KもCTDに位置しています。

5.レット症候群を研究するための生物学的システム

RTTは、単一のMECP2遺伝子の変異に起因する単因性である[4]。このため、多くのRTTトランスジェニック動物[5,57,58]や細胞[59,60,61]のモデル系が作出されるようになった。これらのモデルは、遺伝子改変の有無により、（1）Mecp2構成的ノックアウトマウス[5,58]や脳領域・細胞種特異的Mecp2欠損モデル[62,63]などのMecp2欠損モデル、（2）特定のMecp2変異を持つノックインマウスなどのMecp2変異モデルに分類される [64,65]（Column 2005）。これらの動物モデルは、異なる表現型を示し、寿命も異なる[66]。非常に有用ではあるが、RTT動物モデル研究の解釈にはいくつかの潜在的な注意点があることを認識する必要があるかもしれない。第一に、Mecp2ヘテロ接合体雌性マウスはRTTの状態をより直接的に代表するが、Mecp2ヌル雄性マウスは扱いやすく、より頻繁に使用されている。第二に、ヒトと比較して、マウスはMeCP2欠損の顕著な症状を発生過程の後半に示す[67]。

in vitroのヒトRTT細胞モデル系に関しては、ヒト人工多能性幹（iPS）細胞または胚性幹細胞由来のMeCP2欠損培養神経細胞が使用されています[59,60]。マウスの細胞モデル系には、胚性幹細胞や初代神経幹細胞から分化させた細胞が含まれる[67]。様々なRTTモデル系に関する詳細な情報については、最近の優れたレビュー [68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79] を参照されたい。

6.エピジェネティックな制御機構とMeCP2ホメオスタシスネットワークの制御における役割

MeCP2はエピジェネティックな因子であり、エピジェネティックな制御に関わる最も研究されているタンパク質の一つである。エピジェネティックな機構は、基礎となるDNA配列に直接的な変化を与えることなく、遺伝子発現を制御する。このような機構には、クロマチンリモデリング、DNAメチル化、RNA修飾、ヒストン翻訳後修飾（PTM）、様々な種類の制御RNAの活性が含まれます[80]。エピジェネティックなメカニズムは、発生、老化、および疾患状態において主要な役割を果たすことが示されている[80,81]。以下では、最も研究されているエピジェネティック制御のメカニズム、MeCP2のエピジェネティック制御、およびそのホメオスタシスネットワークについて簡単に説明します。

6.1.クロマチンリモデリング

真核細胞では、ゲノム物質はDNAとDNAと結合したタンパク質（ヒストンと呼ばれる）からなり、これらが一体となって「クロマチン」構造を構成している。147bpのDNAがヒストン8量体（H2A-H2Bの2量体とヒストンH3、H4の各2コピーからなる）とヒストン8量体の周りに折り畳まれて、クロマチン構造の基本単位である「ヌクレオソーム」と呼ばれる繰り返しの単位を形成している。20-50bpのリンカーDNAがヌクレオソーム同士を結びつけている。このリンカーDNAにはDNA結合タンパク質がアクセスできるが、ヌクレオソームは遺伝子転写の負のレギュレーターと考えられている。一群のタンパク質が、特定の遺伝子のプロモーターにおいて、ヌクレオソームの再配置とクロマチンのリモデリングを通じて、遺伝子発現を調節することが示されている[82]。このプロセスは、神経発達の過程で重要であることが示されている[83,84,85]。

6.2.ヒストンの翻訳後修飾

ヒストンのN末端には主にアミノ酸が含まれており、様々なPTMが施されている。リジンなどの特定のアミノ酸は一般的にアセチル化、リン酸化、メチル化、スモイル化、ユビキチン化の標的であり、アルギニンはメチル化またはADPリボシル化されることがある[86, 87]。これらのヒストンマークは、共活性化因子または共抑制因子複合体をリクルートすることによって、遺伝子の転写活性に影響を与えることができる[88]。様々なヒストンPTMは、ユークロマチン領域とヘテロクロマチン領域の境界を決めるような重要なプロセスで重要な役割を担っている。例えば、選択的にサイレンシングされた遺伝子を含むfacultative heterochromatinはH3K27me3に富むが、永久に抑制された遺伝子を含むconstructutive heterochromatin（cenomereなど）はH3K9me3を豊富に含む [89,90,91,92]．

6.3.ノンコーディング RNA

ヒトゲノムには約21,000のタンパク質コード化遺伝子があり、これはそれほど複雑でない種と同様である。しかし、ヒトや他の哺乳類の生理的複雑性に調節的役割を果たす数万個のノンコーディング RNA（ncRNA）が存在する[93]。小分子RNA（長さ約20-30ヌクレオチド）には、小分子干渉RNA（siRNA）、マイクロRNA（miRNA）、ピウィー相互作用RNA（piRNA）などがあり、標的配列に特異的な方法で遺伝子発現を調節している。長いncRNA（典型的には200nt以上）は、複数のレベルで転写調節の重要な役割を担っている[85,94,95]。

6.4.DNAメチル化

DNAメチル化は、おそらく最も重要なエピジェネティック修飾の一つであり、主に5-メチルシトシン（5-mC）として知られるシトシンの第5炭素にメチル基が結合することを特徴としている。このメチル化は、一般にシトシン・グアニン・ジヌクレオチド（CpG）の文脈で行われる。DNAのメチル化は、他のヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミン）を標的として、CpG以外の文脈でも起こり得る[91]。DNAメチル化は最初、遺伝子不活性化のマーカーとして認識されたが、その後、5-ヒドロキシメチルシトシン（5-hmC）の文脈で、遺伝子発現を活性化できることが明らかになった[91,96]。エピジェネティック修飾は、ライターと呼ばれる特定の酵素によって媒介され、リーダーと呼ばれるエフェクタータンパク質によって認識され、可逆的なマークはイレーザーと呼ばれる別の酵素のセットによって除去することができる [80]．

6.5.DNAメチル化の書き手

DNAメチル化のプロセスは、DNMT3AおよびDNMT3Bを含むDNAメチルトランスフェラーゼ（DNMT）酵素によって促進される。これらの酵素はde novo DNAメチル化を担当し、DNMT1は維持のためのDNMTである。DNMT酵素は正常な発生に重要であり、その機能障害は様々な疾患で報告されている。例えば、DNMT1 の変異は「難聴と認知症を伴う遺伝性感覚神経障害 IE 型」と関連している[97,98]。

6.6.DNAメチル化の抹消者

DNAの脱メチル化は、メチル化マークが細胞分裂のたびに希釈され、薄れていくときに受動的に起こることがある。これは、DNMTの産生がまだ始まっていない発生の初期段階で起こり、卵母細胞に由来するDNMT1が細胞分裂によって希釈される。また、Ten-eleven translocation (TET) ファミリーの活性によって触媒される活発なDNA脱メチル化もあり、5-メチルシトシンを5-ヒドロキシメチルシトシンに変換し、最終的に非メチル化シトシンになるまで複数の段階を経ることができる[80, 91,97].DNAのメチル化は、このエピジェネティック修飾を認識し、それに結合する様々なタンパク質ファミリーによって読み取られ、解釈される。Methyl-CpG-binding protein (MBP) ファミリーには複数のメンバーがおり、MeCP2 はこのタンパク質グループのプロトタイプメンバーである[81,99]。

6.7.メチルCpG結合蛋白質ファミリー

このDNAメチル化リーダーファミリーは、メチル化されたDNAにタンパク質が結合しやすくするためのメチルCpG結合ドメインを持っていることが特徴である。11人のメンバーのうち、MeCP2、MBD2、MBD3は、プロモーターのメチル化に好ましく関連し、一般に遺伝子の転写を抑制する。MBD1 はヒストン修飾とヘテロクロマチン形成、MBD4 は DNA 修復に関与していることが多い。MBDタンパク質の調節障害や変異は、RTTのような神経疾患だけでなく、様々な癌に存在する[81,100,101]。MeCP2 は、メチル化された CpG DNA テンプレートに配列特異性なく結合するタンパク質ファミリーの中で最もよく研究されているメンバーである。このグループの最初のメンバー（MeCP1）が少なくとも12個の対称的なメチル化CpGを必要とするのに対し、このグループの2番目で最も豊富なタンパク質（MeCP2）は、単一のメチル化CpGペアに結合することができる[102,103]。

6.8.MECP2/Mecp2遺伝子の構造とMeCP2蛋白質

MECP2遺伝子は、ヒトではX染色体の長腕（Xq28）に、マウスではXqA7.3に配置されている。マウス（Mecp2）およびヒト（MECP2）において、この遺伝子は4つのコーディングエクソンと3つのイントロンから構成されている。その3UTRにある3つのポリアデニル化部位によって、様々な長さのmRNAが転写される。エキソン1とエキソン2の2つの翻訳開始点から、N末端ドメインのみが異なる一般的なスプライスバリアントが生み出される。MeCP2E1アイソフォームは、エキソン1、3、4のコーディング配列から生じ、その転写物が脳内の主要なアイソフォームであることが報告されている。MeCP2E2はエキソン2、3、4によってコードされ、その転写レベルは肝臓、胎盤、前立腺、骨格筋においてMECP2E1よりも高いことが報告されている[46]。

MeCP2タンパク質は、図1に示すように、N末端ドメイン、メチルCpG結合ドメイン、介在ドメイン、転写抑制ドメイン、そして最後にC末端ドメインという5つの主要な機能ドメインから構成されています。ID、TRD、CTDの中に存在する3つのATフックドメインにより、ATリッチDNAとの結合が可能である[104]。一般に、MeCP2は、その主要な非構造化形式（約60％）により、非構造化・無秩序化タンパク質として知られている[105]。MeCP2の2つのアイソフォームのうち、MeCP2E1（以前はMeCP2BまたはMeCP2αと呼ばれていた）は、N末端領域に21の特徴的な残基を持ち、酸性の等電点（pI）は4.24である。もう一つの最初に発見されたアイソフォームであるMeCP2E2（以前はMeCP2AまたはMeCP2βと呼ばれていた）は、N-末端領域に9つの排他的残基を有し、塩基性pIは9.5である。この2つのMeCP2アイソフォームは、クロマチン結合活性に差があることが知られている[106]。

Bird博士らは、MECP2E2に上流のオープンリーディングフレームが存在することで、タンパク質の翻訳を阻害する効果があり、結果としてMeCP2E1がより豊富になる可能性を示唆した[107]。しかし、内在性のMeCP2E1とMeCP2E2アイソフォームを認識する特異的な抗体や試薬が入手できなかったため、9年前に我々のチームがMeCP2E1特異的アイソフォーム抗体の第一世代とバリデーションを報告するまで、研究はそれらの転写解析に限られていた[108]、その後、E1-とE2特異的抗体の両方を報告するようになった[109]。当時開発されたこれらのツールを用いて、私たちの研究室は、MeCP2E1が大脳皮質、海馬、視床、脳幹、小脳などの異なる脳領域に比較的均一に分布すること、一方MeCP2E2がマウスの様々な脳領域で異なる濃度で存在することを報告しました[109]。この結果から、MeCP2E1は発生期の脳で早期に発現が始まり、MeCP2E2は脳発生期の後期に発現し、出生後にピークを迎え、脳領域特異的な検出パターンを持つことが明らかになりました。最近、我々はこの最も研究されていないヒトの脳におけるMeCP2E1とMeCP2E2アイソフォームの違いを解析しました[110]。

6.9.MeCP2の発現と制御

MeCP2の脳特異的な役割は、RTTの神経学的特徴との関連で広く研究されているが、MeCP2は、発現レベルの高い肺や脾臓から発現レベルの低い肝臓、心臓、小腸まで様々な臓器で発見されている[40]。脳では、MeCP2は、ニューロン、神経幹細胞、アストロサイトやオリゴデンドロサイトなどのグリア [43,111,112,113]、ミクログリア [114] で検出されます。これらの細胞種における選択的なMeCP2の欠損は、神経細胞の異常を引き起こし、その後、これらの細胞におけるMeCP2の再発現によって解決される可能性がある[115,116]。一般に、DNAメチル化は、マウス神経幹細胞、ニューロン、アストロサイト、および成体マウスの脳の異なる領域において、細胞種および性別に依存した形でMeCP2アイソフォームが制御される重要なメカニズムである[96,109,113,117,118,119]。

機能面では、MeCP2はもともと転写抑制因子であるmSin3AとHDACからなるコ・リプレッサー複合体と相互作用して遺伝子制御を阻害するものと考えられていた。このような制御的な役割は、クロマチン構造の圧縮や遺伝子サイレンシングにつながる可能性がある[120,121]。NCoR/SMRTは、MeCP2のTRD領域に特異的な結合ドメインを持つ、より最近発見されたもう一つの共リプレッサー複合体である[53]。第一の発見とは対照的に、研究者は、MeCP2がcAMP応答要素結合タンパク質（CREB）をリクルートすることによって転写活性化因子にもなり得ることを示している[122]。また、MeCP2は、脳内のDNAの一般的な修飾であり、活性遺伝子に濃縮されている5-ヒドロキシメチルシトシンに結合すると、転写活性化因子としての役割を果たすことが示唆されている[123]。他の研究は、MeCP2がクロマチンのグローバルレギュレーターの役割を果たすことを示唆している。神経細胞におけるMeCP2レベルは、ヒストンのそれとほぼ同様である。さらに、非メチル化DNAに結合し[124]、ヒストンH1と同様の方法でヌクレオソームをコンパクトにすることができる[125]。MeCP2は、DNAにループを作ることによって、DLX5などのターゲットに影響を与えることもある[126]（図2）。

図2 f:id:inatti17:20220108132148j:image
図2
脳細胞におけるさまざまなMeCP2の機能の模式図：この単純な仮説の漫画は、MeCP2が遺伝子制御を行う概念的な機能特性のいくつかを示している。図は、Zachariah ... から引用・改変したものです。
MeCP2は、複数のメカニズムによって転写および転写後制御されている。MECP2プロモーター領域の上流にある正および負の制御因子がその発現を制御することができる。また、この領域にはMECP2遺伝子のシス調節因子として働くサイレンサーやエンハンサーが存在する[113,128]。さらに、MECP2/MECP2遺伝子の3′UTRにはポリアデニル化部位があり、これが組織特異的に異なる長さの転写産物を生み出す原因となっている。ポリアデニレーションに関与するトランス作用因子は、これらの部位に結合することができる[129,130]。他の遺伝子と同様に、microRNAやヒストンPTMなどのエピジェネティックな因子もMeCP2の制御に影響を与えることができる[81]。私たちの研究室では、DNAメチル化がin vitroの神経幹細胞分化の際にMecp2アイソフォームの発現に影響を与えることを既に示している[113]。さらに、エタノール曝露などの環境負荷が、2種類のDNAメチル化（5-mCと5-hmC）の調節を介して、分化中の脳細胞でMecp2/MeCP2の誤発現を引き起こすことを報告している[96]。最近、我々はMeCP2だけでなく、他のDNAメチル化関連因子もマウスでは株および性別に特異的な制御を示すことを報告した[117,118,119]。

7.MeCP2標的遺伝子。BDNFとその関連シグナルカスケードを中心に

MeCP2の標的遺伝子に関する研究はほとんど重複がなく、これらの標的遺伝子とRTTとの関連はほとんどの場合確立されていない[127]。MeCP2は転写調節因子としてだけでなく、先に説明したようにRNA スプライシングやクロマチン構造に影響を与えるエピジェネティックモジュレーターとしても、これらの研究対象に対して活性化または抑制効果を持つことができる[81]。Dlx5、Fgf2-5、Fut8、Nf1などの遺伝子は、RTTマウスモデル（Mecp2308/y）で観察されたスプライシングにおける変化を示している[131]。脳由来神経栄養因子はMeCP2の重要な標的であり、おそらく最も多く研究されている。MeCP2とのクロストークは、主に動物モデルで研究されています[56,132]。MicroRNAs（miRNA）は、MeCP2およびその制御のための他の重要な標的である。いくつかのmiRNAは、RTTマウスモデルにおいて発現の変化を示している[96,133]。

7.1.脳由来神経栄養因子

脳由来神経栄養因子は、成長因子のニューロトロフィン・ファミリーのメンバーとしてよく知られている。ニューロトロフィンは、トロポミオシン受容体キナーゼ（TRK）および低親和性神経成長因子受容体（p75）（p75ニューロトロフィン受容体（p75NTR）とも呼ばれる）とともに、ニューロンの生存、成熟および分化を調節し、シナプス形成および神経可塑性に関与している［134,135,136］。一般に、ニューロトロフィン遺伝子は、異なるmRNAの転写を開始するためにRNAポリメラーゼマシナリーを募集する主要な調節要素（プロモーター）を有する複数の5′エクソンを有する。すべての転写産物に共通する3′エクソンは、前駆体ペプチドであるプレプロ・ニューロトロフィンをコードするオープンリーディングフレームを含んでいる。異なるニューロトロフィンファミリーのメンバーの遺伝子構造には類似性があるものの、BDNF/Bdnf遺伝子は最も複雑な構造を持ち、それはヒトと齧歯類の間で密接に保存されている。マウス、ラット、ヒトでは、少なくとも8つの相同エキソンが共通しており、これらのエキソンは、代替の上流プロモーターによって制御されている。BDNF/Bdnfのマルチプロモーターの特性は、多様な刺激に対するBDNFの発現のさらなる柔軟性を示唆するものである[137]。

ヒトBDNF遺伝子は、11番染色体上のp13-14領域の約70kbにまたがり、11個のエクソン（I-IXと呼ばれ、VhとVIIIhも含まれる）を含んでいる。タンパク質コード配列はエクソンIX内にあり、交互にスプライシングされたエクソンの異なる上流プロモーターにより、いくつかのBDNF/Bdnf転写物が生成される。エクソンIXには2つのポリアデニル化部位があり、短いスプライシングバリアントと長いスプライシングバリアントを生成して転写産物の数を倍増させる。異なる転写産物が存在するにもかかわらず、すべてのmRNAは単一のタンパク質をコードしている。転写産物の一見冗長な生成は、文脈や細胞型に特異的な要求を制御している [138]。例えば、マウスのエクソンI、IV、V、VII、IXはDNAメチル化によって活性化されるが、別のエクソン群（III、VIII、IX）はヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤によって誘導される [139]。また、3′UTRが短い転写産物はソーマに留まり神経細胞の生存を制御し、3′UTRが長い転写産物は樹状突起に優先的に局在してシナプス可塑性を調節することが明らかにされている[140,141,142]。

7.1.1.BDNFのシグナル伝達 BDNFはトロポミオシン関連キナーゼB（TrkB）に特異的／高親和的に結合する。これにより、TrkBの二量体化と自己リン酸化が起こり、いくつかの下流シグナル伝達カスケードが活性化される。その中には、神経分化を促進するマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）、ニューロンの成長と生存を促進するホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI3K）、シナプス可塑性を促進するホスリパーゼC（PLCγ）経路が含まれています[143]。他のニューロトロフィンと同様に、BDNF は p75（p75NTR としても知られる）に結合することができる。p75NTR は腫瘍壊死タンパク質の一部であり、TrkB シグナルがない状態で p75NTR が活性化すると、プログラム細胞死を含むいくつかのシグナル伝達経路を活性化できる［144］。

p75NTRとTrkB受容体の協同は、複合体に対するmBDNFの親和性を高め、生存促進、成長関連のシグナル伝達が強化されることになる[145,146]。逆に、p75NTRがsortilin（ニューロトロフィンのソーティングを制御する膜貫通タンパク質）とヘテロ二量体を形成すると、生じた複合体はPro-BDNFに対してより高い親和性を獲得する。そして、いくつかのプロアポトーシス経路の誘導を通じて、細胞死シグナルが活性化される [147] 。従って，プロペプチドの生物学的役割は，成熟タンパク質のフォールディングを助けるという伝統的なものだけではないのである．BDNFプロペプチドは，p75NTR受容体に直接結合すると，長期抑圧を促進するシナプスモジュレータとして生物学的に活性であることが示されている[148]．異なる下流シグナル伝達カスケードから、PLCγ経路は、数秒から数分以内に起こる急速なBDNF関連効果を媒介し、他の2つ（MAPKおよびPI3K）は、遺伝子転写における変化を通してよりゆっくりと働くことが示唆されている[145]。

TrkBがTyr490とTyr515でリン酸化されると、Src homology 2 domain containing adaptor protein（Shc）に対する親和性が高くなる。このリン酸化部位に結合すると、成長因子受容体結合タンパク質2 (Grb2) がリクルートされる。Grb2は、RASタンパク質との交換因子であるSon of Sevenless (SOS)と複合体を形成する。RASはMAKカスケードにおいてERK（extra cellular signal-regulated kinase1/2）の上流で作用し、RAFタンパク質のSer/Thrキナーゼを活性化する。それが今度はMEK（MAPキナーゼ／ERKキナーゼ）の活性化につながり、ERK1/2を活性化することができる。活性化されたERKは核に移動し、CREBなどの転写因子を活性化することができる。リン酸化されたCREBは、Bdnf/BDNFプロモーターに結合し、その転写を誘導することができる。BDNF-ERK-CREBシグナル伝達経路は、細胞の生存、シナプス構造、および可塑性に主要な役割を果たします[149,150,151,152]。Tyr816 における TrkB のリン酸化は、イノシトール 1, 4, 5-トリフォスファイト (IP3) とジアシルグリセロール (DAG) を生成する。IP3は内部からのCa2+の放出に関与し、Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼの活性化につながる。その結果、CREBのリン酸化が起こり、MAPK経路と同様のカスケードが継続するようになります[153,154]。BDNFによるPI3Kの活性化は、mTOR（mammalian Target of Rapamycin）をリン酸化する重要なキナーゼであるAKTも活性化するRASの複合作用と関連することがある[155]。mTOR経路を活性化するシグナル伝達カスケードは、タンパク質翻訳の制御に関与しており、そこでBDNFが局所的なタンパク質合成に関与する可能性がある [156,157] 。注目すべきは、私たちのチームの研究で、ヒトRTT脳ではmTOR経路が障害され、リボソーム生合成を制御するプロセスの多段階の制御が損なわれていることが示されたことです。このような異常は、一般的な変異（T158MとR255X）およびまれな変異（G451T）を持つRTT患者の小脳に見出された。リボソーム RNAプロセッシングの制御因子（Nucleolin）が、T158M患者の小脳の神経細胞において、コントロールと比較して異常に再分布していることが明らかになった。これは、この患者の小脳の分子層、顆粒層、プルキンエ細胞層の神経細胞で明らかに検出された。驚いたことに、Mecp2欠損の雄マウスとヘテロ接合体の雌マウスでは、小脳のNucleolinニューロンの分布に異常は認められませんでした[158]。この研究は、トランスジェニックマウスのMecp2遺伝子欠損が、ヒトRTT脳のすべての分子欠損を完全に再現していない可能性を示唆し、RTTモデル系とRTT患者の死後脳のサイドバイサイド解析の重要性を強調している。

7.1.2.BDNF/Bdnf 制御感覚刺激 [159,160,161], グルタミン酸受容体の活性化 [162,163,164], または発作 [165] により神経細胞の膜の脱分極が誘導され，BDNF 転写に正の調節的役割を果たす可能性があります．ヒト BDNF 遺伝子のプロモーター IV の cAMP/Ca2+-response element (CRE) に cAMP response element-binding protein (CREB) が結合することは、このプロモーターからの活動依存的な転写に重要であることが示されています。また、ヒトのプロモーターIXは、神経細胞の活動によって誘導されることがあります。CREとPasRE（basic helix-loop-helix-PAS transcription factor response element）は、このプロモーターの誘導に寄与しています[166]。BDNF/Bdnfの転写は、少なくとも部分的にはエピジェネティックな因子によって制御されていることが報告されている。BDNF/BdnfプロモーターIVのCpGジヌクレオチド中のシトシン残基のメチル化の減少は、神経細胞の活動によって遺伝子が転写誘導されることが示されている。そこでMeCP2は、BDNF/BdnfプロモーターIVの領域でメチル化されたDNAに結合することで、転写調節因子としての役割を果たすことができます[56]。

BDNF転写のもう一つのエピジェネティックな制御因子として、ヒストン修飾を検討した研究がいくつかある。例えば，胎児期から小児期，若年期への移行に伴うBDNFの発現上昇に伴い，活性クロマチンのマーカーであるヒストンメチル基転移酵素H3K4トリメチル化の増加がBDNFプロモーターIおよびIVで示されている[167]．BDNFの発現を調節するエピジェネティックな制御因子として、microRNA（次のセクションで議論）がある。この点に関して、いくつかのマイクロRNAが研究されている。miR-1、miR-106、miR-155、及びmiR191は、BDNF 3′UTRに結合することによりBDNF遺伝子発現を抑制することが示されている[168]。BDNFを標的とすると予測されるmiRNAのリストは長く、miR132はBDNFを制御することが報告されている[169]。

7.1.3.MeCP2 の BDNF 制御における役割 MeCP2 による BDNF 制御については、まだ論争があります。初期の研究では、抑制モデルを支持する意見が多かった。膜の脱分極がBdnfプロモーターIVの結合部位からMeCP2を解放し、Bdnfの転写活性化をもたらすと報告された[56,170]。神経細胞の脱分極によるMeCP2のSer421でのリン酸化[55]とBdnfプロモーターIVでのDNAメチル化の減少[132]は、MeCP2とその共リプレッサー（Sin3aおよびHDAC1）をBdnfプロモーターIVから離脱させる。また、Mecp2欠損マウス（Jaenisch系統のヘミ接合体Mecp2tm1.1Jae変異体雄とcre93 Mecp2-/y）ではBdnf転写とタンパク質の減少が見られ、Bdnf転写におけるMeCP2の活性化の役割が示唆されている [171,172]．
このような矛盾を説明するために、BDNFの制御におけるMeCP2の二重の役割を示唆する他のモデルも存在する[173]。SH-SY5Y 神経芽腫細胞で研究されたモデルに基づいて、MeCP2 はその標的遺伝子と制御複合体に結合したままであり、そのリン酸化によってリクルートされて、これらの標的遺伝子の発現を活性化または抑制するかもしれない [174]。MeCP2 のリン酸化は、この二重の動作モデルにおける唯一の寄与因子ではない。他のエピジェネティックなメカニズムもまた役割を果たすことができる。例えば、Bdnf転写産物の3′UTRを標的とするいくつかのマイクロRNAの転写は、MeCP2によって制御されていることが示されている[96]。さらに、MeCP2の変化は、転写レベルでのBDNF/Bdnfの発現だけでなく、BDNFタンパク質の翻訳または安定性にも影響を与える可能性がある。このことは、BDNFを転写レベルまたはタンパク質レベルで研究した異なるモデル間の不一致のいくつかを説明するかもしれない[175]。

7.1.4.BDNFとRTTの病態 RTTモデルマウスの研究では、RTT様の特徴が現れ始めると同時に、生後3-4週目以降のBDNF発現が低下することが示されている。この減少は、まず脳の尾側部（脳幹と小脳）で発現し、次第に脳全体が侵されるようになる[173]。RTT患者の脳におけるBDNFレベルの低下については、議論のある結果がある。RTT患者の脳脊髄液（CSF）と血清中のBDNFタンパク質レベルは、非対象者と同等であるという2つの報告がある一方で [176,177]、RTT脳サンプル中のBDNFの転写レベルが対照群と比較して低いという他の研究もある。特にタンパク質レベルの評価における技術的な限界が、このような格差の背後にある理由かもしれない [178,179] 。私たちのチームの最近の研究では、RTT脳ではBDNFの転写産物が著しく減少しているが、タンパク質レベルは変化しておらず、少なくとも小脳のプルキンエ細胞では検出パターンに差異があることが示されている[110,180]。上記の議論に加えて、BDNFの機能低下の機能的な大きさは十分に理解されていない。Bdnf欠損マウスを作製するトランスジェニックアプローチにより、Bdnf欠損は、Mecp2欠損、脳や神経細胞（ニューロン）が小さく神経突起がアーバー化、Bdnf欠損マウスやTrkb欠損マウスにおける海馬長期増強の低下といった同等の表現型につながること［181］、不整脈、運動機能の低下［182，183］が立証されています。さらに、Mecp2欠損の雄でBdnfを過剰発現させると、これらのマウスの生存率と運動能力が向上した[171]。
外因性BDNFは血液脳関門（BBB）を通過しないため、レット症候群のような神経発達障害に対する現実的な治療法の選択肢とはならない[184]。しかし、インスリン様成長因子1（IGF-1）は、BBBを通過する能力を有するBDNFと同じシグナル伝達経路の主要な活性化因子であり［185，186］、したがって、RTTの治療薬としてさまざまな臨床試験で使用されている［188，189，190，191，192］。これらの臨床試験は、結果にばらつきがあり [193]、これはRTTの病態が複雑であることに起因している可能性がある。

7.1.5.BDNFとヒト脳における検出の細胞起源 BDNFは最初に脳から単離されたが [194] 、それは必ずしも神経細胞がその主要な細胞起源であることを証明するものでは無い。実際，脳微小血管の内皮細胞もBDNFを産生することがin vitroの研究で明らかにされてから，約20年が経過している[195,196]．長年見過ごされてきたBDNFが、より最近のin vivo研究実験により、成人の脳血管系の内皮細胞で産生されることが明らかになった[197,198]。大脳皮質神経細胞と比較して、脳内皮細胞からのBDNF発現量は50倍も大きいことが報告されている[199]。他のいくつかの研究に基づいて、脳内皮細胞の除去は、脳内のBDNFレベルを有意に減少させる[200]。さらに、異なる研究は、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトを含むグリアがBDNFを合成および放出することを示した[201,202]。私たちが最近報告したBDNF染色の顕著なアストログリア/内皮パターンは、動物モデルや細胞培養系におけるこれまでの知見を、RTTおよび対照ヒト脳の異なる領域にも広げたものです[180]。同時に、ほとんどのモデル系がBDNFの主な供給源として神経細胞に焦点を当てているため、RTT病態生理学におけるMeCP2-BDNFクロストークの役割にさらなる疑問が生じ、これは我々の最近の知見によって補完されている[110]。
BDNFの細胞源に加えて、RTT患者におけるその障害は、私たちのチームの最近の研究が死後のヒトの脳の角度からアプローチした、もう一つの論争である。私たちの最近の研究では、RTTの脳でBDNFの転写が低いことが示されました。しかし、BDNFタンパク質（ウェスタンブロット、ELISA、IHCによって調査）は、同じ傾向を示しませんでした。しかし、意外なことに、RTTの小脳のプルキンエ細胞では、高いBDNFレベルが検出されました。この点で、我々は、マッチングタンパク質に対する転写産物の予測値が低いことを見出したが[110,180]、これは珍しいことではなく、ヒトの脳における複雑な制御機構に起因する可能性がある[203]。しかし，ウェスタンブロットとIHCに用いた抗BDNF抗体が，pro-BDNFと成熟タンパク質を検出できることは注目すべきことである．また、ELISAキットのコーティング抗体も成熟型BDNFとpro-BDNFの両方を検出することができました。ウェスタンブロット実験では、プロBDNFと成熟BDNFを分子サイズによって区別しますが、ELISAとIHCでは、両方のタンパク質の形態を組み合わせて示します。

GABAニューロンとしてのプルキンエ細胞の抑制性を考慮すると、RTT脳ではこの細胞の免疫標識がより強く、成熟BDNFとは逆の機能を持つpro-BDNFのレベルが高いことと関連するかもしれません[148]。ヒトの脳のBDNFを定量的Western blotと定性的IHC解析の2つのアプローチから、小脳では成熟BDNFタンパク質レベルが低く、pro-BDNFレベルが高いことは、実はIHC所見と一致していると報告されました[110,180]。BDNFの検出は、低酸素や神経炎症のような条件下で上昇する[204,205]。このような状態は、さまざまな神経疾患の病因となるが、ヒトRTT脳組織の死後における調査はまだ行われていない。今回の報告は、臨床的に適切な患者の脳組織におけるRTTの病理生物学に貢献するだけでなく、治療の観点からも重要である。主に、内皮細胞がヒト脳におけるBDNFの主要な供給源であると考えることにより、血液脳関門を回避し、非神経細胞源を通して脳内のBDNFレベルを高めることに集中できる可能性がある。

7.2.マイクロRNA

マイクロRNA（miRNA）は、約22-23塩基の長さを持つノンコーディング RNAファミリーのメンバーで、遺伝子サイレンシングにより膨大な数の生命現象を制御することができます。ゲノム上では、miRNA遺伝子は、コーディング遺伝子（宿主遺伝子）のイントロン内やコーディング活性が知られていない領域に、単一遺伝子または遺伝子クラスターとして局在することができます[206]。miRNAの生合成過程は時間的・空間的に厳密に制御されており、その制御低下はいくつかのヒト疾患と関連していることが示されている[207]。

7.2.1.中枢神経系発生におけるmiRNAの役割 miRNAがどのように標的遺伝子を制御しているのかについては、まだ解明されていない点が多くあります。しかし、miRNAが胚のパターニングから神経の分化や可塑性に至る神経系の発達過程に影響を与えることが分かっている[208]。さらに最近の研究では、成人のシナプス可塑性と認知におけるmiRNAの重要な役割も示されています[206]。神経前駆細胞の神経細胞またはグリア細胞への細胞運命決定において、時間的空間的制限または細胞種特異的なmiRNAが役割を果たすことがあります。これは、主に神経細胞については胚発生時に起こり、グリア細胞については出生後早期に継続する。miRNAのような制御RNAは、学習と記憶に関与する顆下領域などの特定の成体脳領域における成体神経新生にも関連しています。さらに、miRNAは、グリアおよび神経細胞のタイプ決定にも関与しています。これらの制御分子は、新しく形成された神経細胞の特定の運命への移動、および神経細胞の極性化（神経細胞のプロセスが軸索コンパートメントと樹状コンパートメントに機能的に分離することを指す）にも関与している。軸索形成と樹状突起分岐は、神経系miRNAが制御する可能性がある他の領域です。また、適切なターゲットとの接続により、ニューロンの成熟にも影響を与えます。シナプスの動的な構造と機能により、シナプスは外部からの刺激に反応する能力を持つ。シナプス可塑性として認識されるこのプロセスは、活動依存的なシナプス前後の生理に対するmiRNAの反応によっても影響を受ける[208]。
まとめると、いくつかの研究により、神経発達のあらゆる側面におけるmiRNAの制御的役割が強調されており、その障害は統合失調症、自閉症、RTTなどのいくつかの神経疾患において観察されている[206]。

7.2.2.miR132の役割と神経構造・機能への影響中枢神経系に存在する多くのmiRNAの中で、miR132は活性依存的に発現しています。このマイクロRNAは脊椎動物間で極めて保存された配列を持ち、転写因子であるCREBによって制御されています[209]。miR132は、神経細胞の形態に影響を与えるだけでなく、神経細胞の機能も制御している。このような活性を裏付ける証拠の一つとして、マウスの網膜におけるBDNFによる軸索分岐がmiR132によって促進されることを示す研究結果があります[210]。この活性制御型miRNAは、マウスやヒヨコにおける樹状突起形成も制御している[211,212]。miR132は樹状突起スパインの形態形成にも関与し、シナプスの可塑性に影響を与える[213,214]。miR132の制御低下は、神経細胞の発達と機能におけるその役割から予想されるように、異なる神経疾患と関連することが示されている。ハンチントン病、統合失調症、双極性障害の患者の脳におけるmiR132のダウンレギュレーションは、いくつかの例である[215,216]。
miR132の場所と機能は、神経細胞に限定されない。そのレベルは免疫関連の文脈で変化し、炎症プロセスにおけるmiR132の関与を示す証拠が増えている。例えば、炎症状態は、単球、マスト細胞、リンパ管内皮細胞などの異なる種類の細胞でmiR132レベルを誘導する。また、ホルモンや栄養状態がmiR132を制御することを示唆する報告もあります[217]。さらに、miR132の機能は、腫瘍形成のような領域を含んでいます。例えば、膵臓癌では非癌の状態と比較してmiR132レベルが減少し、慢性リンパ芽球性白血病では増加することが示されています[218,219]。

7.2.3.miR132によるMeCP2の恒常性制御 MECP2/Mecp2遺伝子の複数のポリアデニル化部位により、短い（約1.8kb）または長い（約10kb）3UTRを持つ転写が行われる。脳内の主な転写産物は、miR132を含むいくつかのmiRNAに対して高度に保存されたmiRNA応答要素（MRE）を持つ長い方である。小さい方の転写産物は、これらの部位を持っていない[220]。出生前のmiR132の基底レベルは低いものの、このマイクロRNAがラット新生児神経細胞におけるBDNFを介した神経突起伸長に寄与していることが示されている。一方、ラット大脳皮質初代ニューロンへのmiR132の導入は、MeCP2のタンパク質レベルに負の影響を及ぼします[221]。フォルスコリンおよびKCl処理は、いずれもCREB経路を介してmiR132を誘導し、MeCP2レベルの減少をもたらします。この研究では、mRNAのレベルが変化していないことから、転写後の効果であることが支持される[169]。著者らはまた、MeCP2の過剰発現だけでなくmiR132のブロッキングがBDNF IIIの転写を増加させる一方で、MeCP2やmiR132 MREの結合部位を持たないBDNF Iには変化がないことを示した。また、Jaenisch Mecp2ノックアウトマウスでは、Bdnf IVとmiR132の両方が減少していた。MeCP2がBDNFレベルを増加させるという同じ著者らの知見と、BDNFがmiR132の発現を活性化するという報告から、MeCP2がBDNFを誘導し、それがmiR132を誘導してMeCP2タンパク質を抑制するというホメオスタシスネットワークが提案された。Mecp2の3′UTRに結合することができるいくつかのmiRNAの中で、miR132は唯一脳に濃縮されています[169]。
別の研究では、胎児期にはmiR132以外のmiRNA（例えば、miR483）がMeCP2タンパク質を抑制することが示されている。しかし、miR132は生後の段階でMeCP2レベルを微調整することができます[222]。進化的に保存された結合部位への結合を介したmiR132によるMeCP2制御は、RTT [169]から薬物乱用 [223]、痛みの伝達 [224]に至る様々な文脈で動物モデルで研究されてきた。しかし、ヒトの細胞や脳サンプルを用いた研究は限られており、動物モデルからの結果とは一致しない[222]。MeCP2の2つの主要なアイソフォームは、そのアミノ酸の96％が同一である。MeCP2E1アイソフォームはわずかに長く（ヒトでは498アミノ酸）、21個のユニークなN末端アミノ酸を持つ。MeCP2E2アイソフォームは12アミノ酸短く、9個のユニークなN-末端アミノ酸を持つ[46,107]。MeCP2E1 アイソフォームは全ての脊椎動物に存在するが、MeCP2E2 アイソフォームは哺乳類にのみ存在する[37]。脳内ではMeCP2E1アイソフォームが優勢であり、2つのアイソフォームが脳領域特異的に発現していることは、我々を含む独立したグループにより、既にマウス脳で示されている[40,107,109]。さらに、この2つのアイソフォームの半減期は非常に異なることが予測されている[225]。

MeCP2の2つのアイソフォームが非常に類似しているという事実と、MeCP2E2の過剰発現の能力がRTTマウスモデルにおける主要なRTT様表現型を防ぐという観察結果は、2つのアイソフォーム間の機能的重複を指し示している[49]。しかし、MECP2E1のみに影響を与える変異がRTTを引き起こし、Mecp2e1特異的ノックアウトがRTTマウスモデルを生み出すという事実[226,227]は、MeCP2E2が生体内のMeCP2E1の欠如を補う能力がないことを示唆している。

ヒトの脳サンプルは限られており、また、これらのサンプルを管理評価することは技術的に困難であるため、ヒトの脳における2つのMeCP2アイソフォームの分布とレベルはほとんど未解明であった。また、MeCP2の制御システムに関する研究は、主に動物モデルを対象として行われてきました。ラット脳では、MeCP2、BDNF、miR132からなる制御ループが存在することが示唆されている。miR132は神経細胞特異的なマイクロRNA（脊椎動物間で高度に保存されている[217]）で、MeCP2を阻害する。このマイクロRNAの発現はBDNFによって誘導され、それ自体はMeCP2によって制御されています[169]。この分野では評判の良い研究ですが、ヒトの脳ではこの制御ループの保存は研究されていません。

8.ヒトの脳から学んだMeCP2-BDNF-miR132の恒常性維持制御成分について

正常なヒトの脳で最も早くMeCP2が発現するのは妊娠10週目で、脳幹と大脳皮質の皮質下ニューロンとCajal-Retziusニューロンで報告されています。MeCP2は、その後、視床、中脳、基底核に出現する。海馬と小脳のMeCP2レベルは高くなく、発生初期には低いレベルを示す。しかし、神経細胞の細胞成熟に伴い、これらの領域のこれらの細胞型のほとんどがMeCP2を発現するようになる。そのことが、RTTの臨床症状の発現が発達の過程で遅れることの説明になるかもしれない[40]。MeCP2タンパク質は核内分布パターンを示すが、一部の神経細胞ではわずかに細胞質での検出が報告されている。この細胞質画分は、翻訳後修飾されたタンパク質であることが示唆されている。初期の免疫組織化学（IHC）研究以来、一貫した課題は、同じ種類の神経細胞内におけるMeCP2染色のレベルが一定でないことであった[18]。レーザースキャンサイトメトリーにより、MeCP2濃度が低い細胞と高い細胞の両方が存在することが確認されている[228]。このような検出された違いは、神経細胞の活動またはMeCP2タンパク質の死後分解の可能性のどちらかに起因している可能性がある[18,40]。他のタンパク質標識に関しては、グリア線維酸性タンパク質（GFAP）がRTT脳でいくらか増加することが報告されている。しかし、これがRTTの主病態の一次的な現象なのか、二次的な現象なのかは不明である[18]。

最近、我々のチームは、ヒトRTT脳において、MECP2アイソフォームが年齢と性をマッチさせた対照群と比較して有意に減少していることを報告しました[110]。我々の発見は、MECP2転写物の有意な低レベル[180]、神経細胞[18,58,229]や非神経細胞RTTサンプル（例えば末梢血）中のMeCP2タンパク質の構造と機能の障害を報告した先行研究と同じラインであった[230]。しかし、MECP2E1/E2転写産物とMeCP2E1/E2タンパク質レベルとの明確な関連は見出せなかった[110]。BDNFとその前駆体も、BDNFの転写産物との一致は見られませんでした。一般に、ヒトの脳におけるタンパク質レベルの多層的な制御は、対応するタンパク質に対する転写産物相関の低い投影値を部分的に説明することができる[203]。タンパク質の安定性、ターンオーバー、発現を制御する細胞種や組織特異的なモニタリングシステムに加えて、転写後および翻訳後の制御機構が、考えられる原因の一部である可能性がある[40]。

我々が最近行ったヒト死後RTT脳の解析では、BDNFは対照群と比較して転写レベルが同様に有意に低いことが示されたが、驚くべきことに、タンパク質レベルは対照群と同程度であった。しかし、ホルマリン固定脳サンプルに関する我々の報告から、MeCP2-BDNF制御ネットワークについて、さらに別の層の複雑さが明らかになった。最近報告されたBDNF標識の結果に基づいて、脳のさまざまな細胞がBDNFに対して陽性であった。そのような細胞には、アストロサイト、ニューロン、内皮細胞などが含まれる。これらの細胞はすべて、BDNFの産生および発現源として、MeCP2のホメオスタシスに貢献する可能性がある。したがって、それぞれのタンパク質の起源となる細胞の種類を考慮せずに、1つの単純な制御機構がMeCP2-BDNFの恒常性を制御していると考えるのは、おそらくあまりにもナイーブな考えであろう。

ネズミの実験で支持されたmiR132の負の制御的役割とは対照的に[169]、ヒトRTT脳では扁桃体、海馬、前頭皮質でMECP2E1/MECP2E2の転写量が少なく、小脳ではmiR132のレベルが低いことが確認されました。この結果は、一般に、ヒトの脳におけるMECP2/MeCP2の恒常性維持にmiR132が保存された役割を持つことを示唆するものではありませんでした。しかし、小脳は他の脳領域とは異なり、RTT脳と対照脳で同程度のmiR132を示すことが示唆された[110]。ヒトの脳のMeCP2-BDNF-miR132恒常性制御ネットワークにおける領域間の違いは、脳の他の部分と各脳領域の細胞組成の違いに由来する可能性があり、この制御ネットワークを制御する統一的なメカニズムがないヒト脳全体の文脈では、各脳領域でより複雑な制御メカニズムとその固有の機能役割が存在することが示唆される。

また、死後の遅れが、神経細胞のMeCP2免疫染色に関する過去のヒトRTT脳研究の結果に影響を与えた可能性があることも示しました[180]。私たちの研究はまた、レット症候群の経過におけるアストログリア細胞の変化に関するより多くの証拠を提供しました[180]。

9.RTTの治療戦略

古典的なRTTの単原性と前臨床モデルにおける症状の可逆性は、この壊滅的な疾患の治療研究に楽観的な見方をもたらしている。呼吸異常のような定量化可能な症状を示すげっ歯類モデルが利用できるため、症状のない自閉症のような一般的な疾患の行動障害と比較して、治療法の評価がより容易になります [231]。MeCP2の機能およびその欠損が神経回路の機能や行動に及ぼす影響についての理解は、潜在的な治療アプローチの基礎となるものである。このような戦略には、（1）遺伝子／タンパク質を置換する、あるいはエピジェネティックに沈黙し不活性なX染色体から野生型アレルを再活性化する分子的方法論、（2）神経回路における役割を回復するためにMeCP2の下流分子および事象（標的遺伝子または分子機能）に合わせた薬理学的戦略、が含まれるであろう[232]。

9.1.分子的治療と遺伝子投与への懸念

MeCP2の過剰は、MECP2重複症候群（MDS）の男児に起こるのと同様の状態であり、発作と活動低下を呈するRTT様の神経機能障害につながる[233,234]。したがって、MECP2を直接標的としてタンパク質を正常化する分子療法は、MeCP2の過剰投与を避けることによって、タンパク質のレベルを狭い許容範囲内に維持する必要がある[231]。一般に、MeCP2レベルが適切な神経細胞は正常な神経細胞構造を持つが、MeCP2レベルが低下した神経細胞は自閉症と関連する。一方、RTTとMDSでは、MeCP2が欠損または機能獲得したニューロンがそれぞれ影響を受ける（図3）。実際、MeCP2の発現量や遺伝子変異と神経細胞の構造特性との間には関係があるのかもしれない。それは、RTT症候群のモデルマウスに関する研究や、in vitroおよびin vivoのマウスおよびヒトのシステムを用いて検出されたシナプス可塑性の欠損によって証明されている[191,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244]。図3は、示されたin vitroおよびin vivoのシステムにおけるMeCP2レベルの報告の影響に基づく、MeCP2関連神経発達障害における神経細胞構造の簡単な図解を提供する[191,235,236,237,238,239,240,241,242,243,244]。

図3 f:id:inatti17:20220108132308j:image
図3
MeCP2レベルは、ニューロンの表現型特性を決定する。MeCP2レベル、ソーマサイズ、神経突起形成、およびヒト疾患との関連性に関して、ニューロンの形態を簡略化して示したものである。

9.2.不活性X染色体上のMECP2を活性化する

この新しい方法は、すでに別の神経発達障害（アンジェルマン症候群）で研究されており、Mecp2-EGFP蛍光レポーターマウスは、ハイスループットな低分子スクリーニングに有用なツールである。この手順にはコストと安定性の問題があるほか、血液脳関門を通過して拡散する活性の高い安全な化合物を利用できるかどうかが、関連する細胞種全体でMeCP2レベルを回復させる上でのもう一つの制約となる。さらに、MECP2を特異的に、または不活性なX全体を標的とすることは、この方法におけるもう1つの懸念である[231,245,246]。

9.3.遺伝子編集ストラテジー

レット症候群の遺伝子治療を研究する最初の試みは、10年以上前にRastegar博士らによって報告されました[111]。我々は、内因性Mecp2プロモーターを持つウイルスベクターが、神経細胞やグリアにおけるMeCP2の内因性発現パターンを再現することにより、遺伝子治療の送達に有効であることを示した[111]。また、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターにより、異常遺伝子の編集や置換が可能になった。この場合、Mecp2 cDNAを搭載したAAV9ベクターの静脈内投与により、雄雌のRTTマウスの症状がある程度正常化した[231,247]。Mecp2の発現を均質に、かつ狭い正常範囲内で送達することは、遺伝子治療の主な課題の1つである[231]。インフレーム早発停止コドンを持つRTT患者の約35%は、ナンセンス変異のリードスルーを可能にする化合物の恩恵を受けるかもしれない[248]。これは、R168X（最も一般的なRTTを引き起こす切断型変異）マウス線維芽細胞を培養して有効であることが示されている[109,249]。

9.4.タンパク質置換の課題

適切なレベルのMeCP2をBBBに均一かつ継続的に供給することは、タンパク質置換の大きな課題である。細胞および核に至るまでの細胞内レベルでタンパク質を十分に浸透させ、翻訳後修飾が規則正しく行われるようにすることも、この方法において克服すべき障害である[231]。

9.5.MeCP2の下流シグナル伝達経路をターゲットにする

古典的な神経伝達物質や神経調節物質のシグナル伝達、BDNFやIGF-1などの成長因子シグナル伝達、さらに代謝シグナル、コレステロール生合成、ミトコンドリア機能などがMeCP2を標的とした主な経路として知られています[250,251]。1つの経路に対して調製された薬剤は、RTT症状の全領域を治療しない可能性がある。しかし、呼吸異常のような1つの主症状を改善することは、RTT患者のQOLにかなりの影響を与える可能性がある[231]。

9.6.臨床試験

RTTのような希少疾患の臨床試験には、いくつかの課題があります。RTTに関連する膨大な数の突然変異と、参加者の数が限られていることが障害の2つである。現在進行中または終了したいくつかの試験から、並行、無作為、二重盲検、プラセボ対照のものはまれであり、どれも実際に使用できるレベルには達していない [6,231] 。

10.10.閉会の辞

MeCP2の発見から約30年、レット症候群との関係も20年以上知られている今日、この悲惨な疾患に対する効果的な治療法はまだ模索されているところです。この点に関して、基礎科学者と臨床科学者の集中的な努力により、我々の理解は非常に進んでいる。動物モデルや細胞モデルによって、この疾患の病態生理や治療介入のための機構的アプローチを理解するための一歩が踏み出されたのです。しかし、死後のヒト脳組織を用いた研究は、その困難さや限界にもかかわらず、実際の複雑な病状について貴重な情報を提供してくれることは言うまでもない。MeCP2の脳内での役割は多岐にわたるため、研究を進めれば進めるほど、レット症候群のようなMeCP2関連神経発達障害の究極の治療法を見出すための新たな疑問や課題に直面することは明らかである。