ASDのPb及び微量元素の評価
自閉スペクトラム症における尿中鉛（Pb）および必須微量元素の評価：マレーシアの就学前児童におけるケースコントロール研究
Mohd Shahrol Abd Wahilら、Biol Trace Elem Res、2022 Jan.
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概要
鉛（Pb）は環境中に豊富に存在する重金属であり、微量であっても小児に神経毒性を引き起こすことが知られている。しかし、微量元素のカルシウム（Ca）、マグネシウム（Mg）、亜鉛（Zn）、鉄（Fe）は神経発達の保護作用があり、子どもにとって不可欠である。本研究の第一の目的は、就学前児童の自閉症スペクトラム障害（ASD）の発達における鉛と微量元素の役割を評価することである。3歳から6歳のASD児81名と定型発達（TD）児74名が研究に参加した。自記式のオンライン質問票を保護者が記入した。朝一番の尿サンプルを無菌ポリテンの尿容器に採取し、誘導結合プラズマ質量分析計（ICP-MS）を用いて、Pb、Ca、Mg、Zn、Feを測定した。群間比較の結果、ASD児の尿中Pb、Mg、Zn、Fe濃度はTD児より有意に低いことがわかった。ASDのオッズは、尿中ZnとFeがそれぞれ1.0μg/dL増加するごとに、5.0%と23.0%有意に減少した。相互作用後の解析では、ZnとPbの尿中濃度が1.0μg/dL増加するごとに、ASDのオッズはそれぞれ11.0%と0.1%有意に減少した。ASD児の尿中Pb濃度がTD児より有意に低いのは、解毒機構が弱いためと思われる。また、ASD児の尿中ZnおよびFe濃度が有意に低いことは、Pbの神経毒性作用を増強している可能性がある。
キーワード自閉症、児童、鉛、微量元素、尿中.
はじめに
鉛（Pb）は、地殻中に存在する天然由来の非鉄重金属元素である。最も毒性の強い汚染物質の一つであるにもかかわらず、Pbはその可鍛性と耐腐食性により、世界中で様々な産業や消費者向け製品に使用されてきた[1]。現在の産業革命、急速な都市化、経済発展により、人間が鉛にさらされることは避けられない。鉛は、人体に対して強力かつ不可逆的な健康影響を及ぼすことは注目に値する。例えば、鉛は、極めて低濃度であっても、多くの疾患の潜在的な補因子、イニシエータ、プロモータとなりうる[2]。したがって、世界中の多くの国で、人間が頻繁に鉛にさらされることは、世界的な環境保健上の関心事となっている。ヒトは、鉛を経口摂取したり、鉛で汚染された土壌や粉塵を吸入することによって、鉛に曝露される可能性がある[3]。
幼い子どもは、独特の生理的特徴を持つため、大人よりも鉛の曝露に対して脆弱である。成人と比較して、子供の消化器官は経口摂取量 [3] と鉛の吸収率 [4] が高く、絶食時や必須微量元素の不足時にはさらに増加する可能性がある [5, 6]。さらに、幼児の口移し行動により、鉛に暴露される可能性がある [7]。幼児は、生来の好奇心と非食品と食物の区別がつかないために、しばしばピカ（非食品を食べたいという持続的かつ強迫的な欲求）の習慣がある [8]。消化器官は別として、鉛への暴露は、未成熟で発達途上にある子供の神経系に容易に害を及ぼす可能性がある[9]。
環境中には、鉛の採掘と精錬、鉛関連産業（特に電池と電子機器）、屋内外の鉛系塗料、水道管、はんだ、家庭用品（例：色鉛筆、クレヨン、鉛系塗料で塗装したおもちゃ、鉛釉の陶器、タバコ、鉛入りガソリン、化粧品、伝統療法）、鉛を含む趣味（例：釣り、絵画、電子機器の収集）等多くの鉛源候補がある [4, 10-14]．鉛関連産業の労働者は、衣服、履物、皮膚、その他の身の回りのものについた鉛の粉塵を自宅に持ち帰ることにより、「持ち帰り汚染」の一因となる可能性がある [4, 15]。都市部に住む子供たちは、他の鉛汚染源（土壌や塵など）や人 為的活動（道路交通、産業、建設や解体など）によって生じる排出物 にさらされる可能性がある [2, 16]。これらは、環境内で急速に空気中を拡散し、食物連鎖を汚染し、最終的に人体に入る[17]。小児期の鉛曝露のその他の関連する危険因子は、両親の教育レベル、社会的地位、子供の行動、習慣、食事、栄養状態である[18]。
小児期の鉛中毒は予防可能な環境疾患であり、健康や行動に長期的な悪影響を及ぼす。鉛に曝された子どもは、神経系の不可逆的な形態的・分子的変化を経験しやすい[19-21]。鉛の毒性は中枢神経機能に様々な悪影響を及ぼすことがよく知られている。その結果、これらの影響は、広範な発達遅延、知的・行動的障害、多動性、社会的引きこもり、粗大・微細運動能力障害、知能指数（IQ）低下のリスクを増大させる [22-27]。さらに、これらの影響は、出生後数時間以内の高い鉛濃度と関連している[28]。
多くの先進国では、鉛を規制し管理するための政府の法律や法整備が有効であるため、現在では小児に急性高濃度の鉛中毒が起こることはほとんどない[29]。これらの制御手段の例は、ガソリンや家庭用塗料に含まれる鉛の段階的廃止や、産業排出物、水中鉛などの削減である[29]。しかし、慢性的な低鉛毒性濃度も同様に心配され、子供たちに多く見られる[30]。血中鉛濃度（BLL）が10.0μg/dL以下の子供では、数多くの神経認知および神経行動学的な影響が観察された[31-36]。米国疾病管理予防センター（CDC）は当初、BLLの上昇を10.0μg/dL以上と定義した[37, 38]。しかし、その後、CDCは2012年にその値を5.0μg/dLに引き下げました[39, 40]。カットオフBLL濃度にかかわらず、子どもの進行性の神経発達に悪影響を及ぼすため、どの鉛レベルも安全と見なすことはできない[41, 42]。
自閉症スペクトラム障害（ASD）は、アメリカ精神医学会の『精神障害の診断と統計マニュアル第5版』（DSM-5）に記載されているように、さまざまな神経発達障害を説明するものである[43]。社会的行動の異常、コミュニケーションや相互作用への無関心、言語障害、反復的で強迫的な行動、狭い焦点の硬直した興味によって特徴付けられる[44]。1943年に10,000人の子どもあたり4.5例の有病率で初めて記述されて以来［45］、ASDの有病率は大きく増加している［46-50］。ASDの原因および病因については、依然として議論の余地がある。現在、コンセンサスが得られていないため、様々な生物医学分野の研究者がASDの複数の可能性のある原因を研究している。
ASDの発症に環境因子（神経毒性重金属への曝露など）が果たす役割は見過ごせない。ASDの広いスペクトラムは、この疾患の表現型の不均一性が、主として遺伝的障害に起因するのではなく、特定の環境因子への曝露に起因する可能性をも示唆している[51]。神経毒性および重金属（Pbを含む）曝露は、神経発達障害の原因と関連している[52]。これまでの研究では、Pbは発達中のヒトの脳に損傷を与え、広範な神経発達障害を引き起こすと報告されている [25、36、53]。線量毒性のレベルに応じて、障害は明白な臨床症状（高用量毒性）から不顕性機能障害（低用量慢性毒性）に及ぶ可能性がある [25、36、53]。
カルシウム（Ca）、マグネシウム（Mg）、亜鉛（Zn）および鉄（Fe）を含む必須微量元素は、子供の正常な脳の発達、神経伝達物質合成の異化、細胞代謝過程、神経伝達物質に関連する代謝および運動発達に重要な役割を果たす[54-60]。したがって、これらの元素のレベルの変化やそのアンバランスは、神経伝達物質の機能不全につながる可能性がある。神経伝達物質の機能障害は、神経疾患や行動障害を含む多くの病状や疾患において観察されている[61-63]。しかし、ASD発症におけるこれらの元素の役割についてはあまり知られていない。ASDでは必須微量元素が興奮性シナプスと抑制性シナプスを機能不全に陥らせたことが示唆されている[64]。
主にCaは神経発達に重要であり、シナプスの発達と機能を調節することでASDの予防と治療効果をもたらす可能性がある[65]。Caはしばしば標的タンパク質と迅速に結合し、その後Caチャネルの機能を調節し、Caシグナルを発生させる[66-68]。Mgは、γ-アミノ酪酸（GABA）シグナルを調節する体内で4番目に調節的な陽イオンである[69, 70]。また、Mgは銅-亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（CuZn-SOD）および細胞から放出される一酸化窒素を活性化する[71]。CuZn-SODと一酸化窒素は、脳の発達と機能的な幸福に重要である[71]。Znは興奮性シナプスに関連するPro-SAP/Shankタンパク質の足場として必要であり、Zn濃度の低さはASDと関連している[72]。一方、FeはDNA合成、遺伝子発現、髄鞘形成、神経伝達、ミトコンドリア電子輸送に必須な元素である[73]。これらの機能は中枢神経系にとって極めて重要である。したがって、Feの欠乏は、脳における神経伝達プロセス、ミエリン形成、エネルギー代謝を損ない、これが小児の行動および認知発達の遅れを引き起こすと考えられた[74, 75]。
乳製品や粉ミルクを定期的に摂取することは、子どもの健康に有益である[76]。これらの食品は、Caを中心とする微量栄養素を多量に摂取できる高い栄養価を有している[76]。しかし、Caの過剰摂取は、腎石症、ミルクアルカリ症候群を引き起こし、Mg、Zn、Feなどの他の必須微量元素の吸収を阻害する可能性がある[77]。Mgは、葉野菜、豆類、ナッツ類、種子類、全粒穀物、動物性食品、飲料に広く分布している[77]。Zn源は、タンパク質が豊富な植物（例えば、穀物や豆類）及び動物性タンパク質食品のいずれかに含まれる[78]。フィチン酸塩（例：全粒穀物、豆類、ナッツ類、種子類）と食事性CaはZn吸収を阻害し、タンパク質はZn吸収を促進することが知られていた[77]。Feの主な食事源は3つある：(i)母乳（Feがラクトフェリンと結合している）、(ii)ヘムFe（肉、鶏肉、魚）、(iii)非ヘムFe（例えば、ほうれん草、レンコン、カボチャ種子、豆、ナット、強化穀物） [79]．非ヘム鉄の吸収は、アスコルビン酸や有機酸（例：肉、鶏肉、魚介類）、発酵野菜、発酵醤油などの鉄吸収促進因子と鉄吸収阻害因子（例：フィチン酸やイノシトールリン酸、鉄結合ポリフェノール、カルシウム、大豆タンパク質、野菜タンパク質）のトータルネット効果によって決まる [77]．
マレーシアの都市部では、鉛の曝露は一般的である。2000年には、10.0μg/dLを超えるBLLを持つ子どもの有病率は、クアラルンプールの都市部で11.7％であった[80]。2015年の研究では，マラッカ都市部の子どもの27.0％が10.0μg/dLを超える血中鉛値を有していたことが明らかにされた[81]。クアラルンプール連邦直轄領はマレーシアの首都であり、国内で最も人口の多い都市地域を形成している。それは、この都市のますます高まるグローバルな志向と、より広い都市地域に対するその意味合いである[82]。市の総面積は243.70 km2 (24,221.05 ha)で、百パーセント市街地である。2005年の人口は1,556,200人であり、平均人口密度は1ヘクタールあたり64人であった[83]。2018年には1,790,000人に増加した[84]。クアラルンプールの急速な都市化によって環境汚染が進み，子どもたちは神経毒性のある重金属，特にPbにさらされる。したがって、クアラルンプールはこの研究を実施するのに最も適切な場所であった。我々の知る限り、マレーシアの就学前児童におけるASDの尿中鉛と必須微量元素を評価した研究はない。そこで本研究では、マレーシアの就学前児童のASD発症におけるPbと必須微量元素の役割を評価することを主目的とした。
方法論
今回の研究プロトコルは、マレーシア国立大学（UKM）研究倫理委員会およびマレーシア保健省（MOH）医学研究倫理委員会の承認を得ている。すべての手順は、ヘルシンキ宣言（1964年）およびその後の改訂版の原則に従って行われた。参加は任意であり、研究前に両親または法的な世話人からインフォームド・コンセントを文書で得た。この観察型アンマッチ症例対照研究は、2020年1月15日から3月15日まで、クアラルンプールの未就学児を対象に実施された。本研究は、マレーシアにおけるCOVID-19のアウトブレイクによる最初のMovement Control Order（MCO）前に完了した。
ASD児81名、定型発達児（TD）74名の計8名が登録されました。すべての子どもは、3歳から6歳のマレーシア国民である。両グループとも、学校の許可を得て、生徒の名簿から無作為に選ばれた。ASD児は、クアラルンプールのセントゥール市にある国立自閉症リハビリテーションセンター（GENIUS KURNIA）から採用された。このセンターはマレーシア教育省（MOE）により管理されている。ASDの臨床診断は、政府の三次病院に勤務する小児科医によって行われた。診断はDSM-5の基準と国際疾病分類-10（ICD-10）に基づいて行われた。対照群のTD児は、公立幼稚園（4～6歳）、すなわちTABIKA Department of Community Development（KEMAS）および公立保育園（2～4歳）、すなわちTASKA KEMASから募集された。プリスクールと保育園は、クアラルンプールのセントゥール市に位置している。
この2つの施設は、農村開発省（MRD）傘下の幼児教育部門によって設立・運営されています。これらの施設は、MOE（MOE under the National Preschool Standard Curriculum）、National Early Childhood Care and Development Policy、National PERMATA Curriculum [85]に基づいて運営されている。TD児は「健康」であると宣言された。彼らは，M-CHAT（Modified Checklist for Autism in Toddlers）スクリーニングと生後18ヶ月と36ヶ月のフォローアップ時の通常の子どもの健康評価に基づいて小児科医が検証したように，ASDの既知の特徴を持たなかった。両群とも、以下の除外基準を用いた。(i) 先天性異常または症候群、(ii) 神経発達障害または神経行動障害、(iii) 内分泌障害、(iv) 急性の感染症、外科的疾患、外傷性疾患、(v) 現在専門家が処方する定期内服薬または輸液薬（化学療法）、重金属除去用のキレート療法を行っている。
研究者は、電話、メッセージ、電子メールを通じて、各参加者の親（父親または母親）に、自記式のオンラインアンケート（Googleフォーム）に回答するよう通知した。本研究では、いくつかの理由から、オンラインで情報を収集するこの方法が好まれた。(i) 電話やコンピュータから簡単にアクセスできる、(ii) ユーザフレンドリー、(iii) いつでもできる（特に日中忙しい共働きの親にとって）、(iv) データ管理がしやすい（例：記録の保存、機密性、データ分析）、(v) マレーシアで発生したCOVID-19の集団感染の際に閉鎖接触を通じたCOVID-19感染の危険性に対する予防措置、などである。研究者は，質問票の記入が困難な保護者に対して，電話，メッセージ，電子メールを通じて支援した．質問票は、親子の社会・人口統計的背景、子どもの発達段階、ASDの素因を示す危険因子（妊娠合併症、早産、授乳、自閉症の家族歴など）、鉛への環境曝露、鉛に関する親の知識評価、子どもの食事パターンに関する情報を引き出すよう設計されていた。子どもの身体測定パラメータ（身長、体重など）は、身長測定台が付属した校正済みのデジタル体重計（オムロン社製）を用いて測定した。教室にいる研究者が測定値を記録した。
朝一番の尿は、20.0%の硝酸溶液で前処理した滅菌ポリテンの尿容器に、保護者が自宅で採取し、脱イオン水で2回すすぎました。実験に先立ち、親は研究者から尿サンプルの正しい採取方法についてアドバイスを受けた。(i) 採尿は清潔なキャッチボールであること (ii) 採尿量は5.0～10.0 mLであること (iii) 滅菌ポリテンの尿容器は洗剤、ボディソープ、その他の異物で汚染されていないこと (iv) 希釈効果を避けるために尿サンプルに水を加えないこと (v) 尿容器とバイオハザードのジッパーバッグを適切に閉めること。子どもたちは、通常通り食べ物や飲み物を摂取することができた。尿サンプルは、保護者が子供を自閉症リハビリテーションセンター、幼稚園、保育園に送っている間に、当日研究者に届けられた。尿サンプルはコード番号でラベル付けされ、24時間以内にセランゴール州バンギのUKM科学技術学部にある公認環境研究所に搬入された。
実験室では、0.2%硝酸（HNO3）溶液10.0 mLに尿サンプル1.0 mLを1:10の割合で加えて尿サンプルを調製した。この調製作業は、尿サンプルに含まれる有機物の消化過程を可能にするために不可欠であった。次に、調製した尿サンプルを、PerkinElmer SCIEX™ ELAN® 9000 誘導結合プラズマ質量分析計 (ICP-MS; PerkinElmer Inc., Shelton, CT 06484, USA) を用いて Pb およびその他の必須微量元素 (Ca, Mg, Zn および Fe) を分析した。この操作系を用いた各元素の検出限界は以下の通りである。Pb 1.0-10.0 part per trillion (ppt), Ca 10.0-100.0 ppt, Mg 1.0-10.0 ppt, Zn 1.0-10.0 ppt, Fe 1.0-10.0 ppt.Universal Data Acquisition Standards Kit (Perkin Elmer Inc., Shelton, CT 06484, USA) で調製した標準溶液を用いてシステムの校正を行った。内部オンライン標準化は、イットリウムとロジウムの10.0 μg/L溶液 Pure Single-Element Standard (Perkin Elmer Inc., Shelton, CT 06484, USA) [86] を用いて、マトリックス粘度の違いを評価するために実施した。
アンケートと実験室のICP-MSの結果のデータセットは、IBM Statistical Package for Social Sciences (SPSS) ソフトウェア（バージョン22、IBM、シカゴ、IL、米国）を使って分析された。統計解析の前に、データの正規性をグラフ（ヒストグラムとQ-Qプロットに基づく）および統計（歪度、尖度、Shapiro-Wilks/Kolmogorov-Smirnov統計に基づく）的に検討した。各参加者の人口統計学的パラメータについて頻度とパーセンテージを算出した。鉛レベル（平均±標準偏差）および他の必須微量元素（Ca、Mg、Zn、Fe）のグループ差は、スチューデントのt検定（正規分布の場合）またはMann-Whitney U検定（非正規分布の場合）を用いて評価された。潜在的な関連危険因子と交絡因子（量的変数）も、上記の2つの方法のいずれかを用いて評価した。また、記述統計として、分析した要素の中央値、四分位範囲（IQR）、最小値、最大値を使用した。カテゴリー変数はカイ二乗検定を用い、頻度と生率で表示した。尿中の元素濃度間の相関の大きさは、ピアソン相関検定（正規分布の場合）およびスピアマン順位相関検定（非正規分布検定の場合）を用いて分析された。測定元素の精度を評価し、元素のカットオフ点を選択するための包括的なツールとして、受信者動作特性（ROC）分析を実施した。ASDに関連する因子（独立変数には重金属、Pbを含む）を評価するために、単純ロジスティック回帰分析および重回帰分析を実施した。最終的な予測モデルは、要因の効果（オッズ比）を推定することを可能にした。本研究では、p値0.05未満を統計的に有意とみなした。
結果
図11にASD児とTD児の尿中鉛濃度レベルと必須微量元素（Ca, Mg, Zn, Fe）の年齢（月齢）別比較を示す。元素の濃度レベルのデータは正規分布していなかった。そこで、ノンパラメトリック検定を用いて、必須微量元素のデータを解析した。外れ値は保持し、真の所見を保持するために対数変換は行わなかった。ASD児とTD児の一般的な特徴を表1に示す。
図1
ASD児とTD児の尿中鉛と必須微量元素（Ca, Mg, Zn, Fe）の濃度を月齢で比較した。線は濃度の95.0%信頼区間（CI）を表す。
本調査における回答者の特徴および各変数の尿中鉛濃度について
合計155名の未就学児（ASD児81名、TD児74名）が研究に参加した。男女比は、ASD児が約5：1、TD児が約1：1であった（p＜0.001）。両群の子どものほとんどがマレー人であった。ASD児とTD児のマレー人比率は、それぞれ75.0％と94.6％であった（p＝0.003）。ASDであるにもかかわらず、3歳の時点で話すことができたASD児は約17.3％であった。一方、TD児は、話すことができることが対照群の対象基準の一つであったため、全員（100.0%）が3歳の時点で話すことができた。
ASD児の親はTD児の親より約1歳年上であった（p＝0.047）。各群の親の年齢はほとんどが30歳以上であり（p < 0.001）、受胎時の親の年齢の代理が適切であることが示された。ASD児の半数以上が第一子であったのに対し、TD児の約30.0％は第二子であった（p＜0.001）。ほとんどの親が中等教育を受けており（p＜0.001）、B40所得層（月5000.00RM以下）であった（p＜0.001）。
ASD児の大多数はクアラルンプール郊外、主にセランゴール州に住んでいた。一方、TD児の多くはクアラルンプールに住んでいた（p＜0.001）。ASD児の出生地は公立病院（51.9％）、クアラルンプール市外（63.0％）であった（p＜0.001）。一方、TD児の多くは、クアラルンプール市内（56.8%）の公立病院（85.1%）で生まれた（p＝0.014）。ASD児の多くは中層住宅（テラスハウス32.1%，コンドミニアム32.1%）に滞在していたが，TD児の多くは平屋（54.1%）に滞在していた。家屋は，ASD群（22.28±14.62年）ではTD児（18.28±9.78年）に比べ古かった（p＝0.045）。
保護者の多くは非喫煙者であった（ASD児群65.4%、TD児群81.1%）（p=0.011）。保護者は職場における鉛のリスクはないと主張した（ASD児群93.8％、TD児群82.4％）（p＝0.027）。親の性別、子どもの年齢、子どもの予防接種状況、子どもの BMI、家族の ASD、産科的危険因子、家の位置（幹線道路、工場、建設現場の近く）、飲料水の供給源について、群間で有意差はなかった（p＞0.05）。しかし，ASD児では出生地（p＝0.046），授乳期間（p＝0.013），TD児では家の建設現場への近さ（p＝0.038）で尿中Pb濃度の群間平均に有意差がみられた．
図に示すようにFig.22 and Table Table2,2のように、尿中鉛と必須微量元素の実験室分析では、Ca（p = 0.096）を除いて、群間で統計的に有意な差が認められた（p < 0.05）。驚くべきことに、ASD児の尿中Pb濃度はTD児（平均0.58±0.41μg/dL）に比べ有意に低かった（p＜0.05）。また、尿中のMg、Zn、FeもTD児に比べASD児の方が低かった。さらに、すべての男子児童と4歳以上の児童について評価を行った。その結果、すべての元素で同様の傾向がみられた。しかし、元素の平均値には、グループ間で顕著な差が見られた。4歳以下では、ASD児の方がTD児よりもすべての項目で高かった。しかし、Ca（p＝0.002）を除いて、統計的に有意な結果は得られていない（p＞0.05）。
箱ひげ図は、ASD児とTD児の尿中鉛と必須微量元素（Ca、Mg、Zn、Fe）の平均濃度を、全参加者、男子児童、女子児童の間で比較したものである。
ASD群とTD群の尿中鉛と必須微量元素濃度について
Table Table3,3に示すように、全体的な相関分析では、尿中鉛とCaを除く必須微量元素との間に有意な正の相関が示された（r = -0.01, p > 0.05）。この相関関係で示された関連レベルは、非常に弱いもの（Pb × Mg, r = 0.19）から中程度（Pb × Zn, r = 0.44）の範囲であった。必須微量元素間の相関は，弱い相関（Ca × Zn, r = 0.25）から非常に強い相関（Ca × Fe, r = 0.87）までの有意な正の相関を示した。同様の傾向は、すべての男子児童（n = 107）および4歳以上の児童（n = 140）において認められた。ASD児およびTD児群では，相関分析の結果，尿中鉛と必須微量元素との間には，男子ASD児（n = 68）のPb × Zn（r = 0.26，p > 0.05）を除き，有意な正の相関が認められなかった。
ASD群とTD群の尿中の調査元素レベルの相関関係
必須微量元素間の全体的な相関は、弱い相関（Ca × Zn、r = 0.25）から非常に強い相関（Ca × Fe、r = 0.87）まであり、有意な正の相関があることがわかった。同様の傾向は、男子児童全員（n=107）、4歳以上児童全員（n=140）、ASD児童全員（n=81）、男子ASD児童（n=68）、4歳以上ASD児童（n=76）にも認められた。必須微量元素の相関は，全TD児（n＝74）および4歳以上のTD児（n＝64）で中程度から非常に良い相関を示し，男性TD児（n＝39）では優れた相関を示した．尿中CaとFeの相関は、異なるグループ間で良好から良好な相関が持続した（相関係数、rは0.64から0.97）。尿中PbとCaの相関は，有意ではないが，全児童（n＝155），男性ASD児（n＝68），4歳以下ASD児（n＝5），女性TD児（n＝35），4歳以下TD児（n＝10）で負の非常に弱い〜弱い相関を示した．
表Table44は、ROC曲線分析を用いて、155人の子供たちの各尿成分のカットオフ点を示したものである。尿中PbとZnの曲線下面積は、1に最も近い有意な値を示した（それぞれ0.84と0.81）。一方，尿中 Ca，Mg，Fe は 0.5 に最も近い値を示した（それぞれ 0.57，0.59，0.65）．すべての元素のカットオフ値は標準基準値の範囲内であった。
ROC曲線解析による155人の尿中成分のカットオフ値の決定と標準的な文献との比較
表Table55は、両群におけるASDの潜在的関連因子の多重ロジスティック回帰分析結果である。親の学歴、子どもの民族性、子どもの性別、親の喫煙状況がASDの有意な関連因子として同定された。第三次教育を受けた親は、中等教育を受けた親と比較して、ASD児を持つ確率が26倍であった（OR = 26.15, 95% CI 7.10, 96.38, p < 0.001）。非マレー人の子どものASDのオッズは、マレー人の子どもに比べて7.5倍高かった（OR = 7.52, 95% CI 1.62, 34.85, p = 0.010）。男性の子どものASDのオッズは、女性の子どもの8.5倍であった（OR = 8.52, 95% CI 2.76, 26.28, p < 0.001）．元喫煙者の親は、非喫煙者の親と比較して、ASD児を持つ確率が25倍であった（OR = 25.29, 95% CI 4.03, 158.68, p = 0.001）。
ASDの関連因子の多重ロジスティック回帰分析結果
Table Table66 は、尿中 Pb と必須微量元素の多重ロジスティック回帰分析結果である。尿中PbとCa、PbとMg、PbとZn、PbとFeの交互作用は有意であった。したがって、これらの交互作用も多重ロジスティック回帰分析に含めた。さらに相互作用を解析した結果、尿中Pbが1.0μg/dL増加するごとにASDのオッズは0.1％有意に減少した（OR = 0.001, 95% CI 0.00, 0.89, p = 0.046 ）。ASDのオッズは、尿中Caが1.0μg/dL増加するごとに24.0％有意に増加した（OR = 1.24, 95% CI 1.13, 1.36, p < 0.001）．さらに交互作用を解析したところ、ASDのオッズは尿中Caが1.0μg/dL増加するごとに4.0％だけ増加した。しかし、この結果は有意ではなかった（OR = 1.24, 95% CI 1.13, 1.36, p < 0.001）。尿中Znが1.0μg/dL増加するごとに、ASDのオッズは5.0％減少した（OR = 0.95, 95% CI 0.91, 0.99, p = 0.008）。しかし、さらに交互作用を解析したところ、尿中Znが1.0μg/dL増加するごとにASDのオッズは11.0％有意に減少した（OR = 0.89, 95% CI 0.83, 0.93, p = 0.001）。尿中Feが1.0μg/dL増加するごとに、ASDのオッズは23.0%減少した（OR = 0.77, 95% CI 0.69, 0.87, p <0.001）．また、尿中鉄濃度が1.0μg/dL増加するごとにASDのオッズは5.0%減少した。しかし、この結果は有意ではなかった（OR = 0.95, 95% CI 0.73, 1.24, p = 0.698）。
尿中Pbと必須微量元素の多重ロジスティック回帰分析結果
ディスカッション
Pbの体内負担を評価するバイオモニターとしての尿中Pb
尿中の鉛の定量は、血漿から拡散し、腎臓を通して排泄された吸収された鉛を反映していると考えられ、全排泄量の約3分の2を占める[87, 88]。尿中鉛は、過去数日から数週間以内の鉛曝露を反映していると理解されている [88, 89]。また、長期にわたる鉛の被曝の可能性も説明できる [87, 90]。血液から吸収された鉛は石灰化した組織（例：骨）に沈着し、何十年も貯蔵されることがある [91, 92]。Pbは、年齢や被ばく強度に応じて、骨の回転速度に基づき、コンパクト構造（回転速度が遅い）または海綿状構造（回転速度が速い）［92］から、石灰化組織からゆっくりと放出される［93］。加えて、幼児の継続的な成長は、骨格形成のための絶え間ない骨リモデリングを示している。この絶え間ない骨のリモデリングは、骨に蓄積された鉛が血漿中に継続的に放出される内因性汚染に寄与する [92, 94]。皮質骨は海綿骨に比べ、1日に尿中に排泄される鉛の濃度が約2倍以上である[95]。
24 時間採尿法は、多くの臨床研究で頻繁に使用されているが、限界がある。その限界とは、この方法が不便であることと、尿試料が重金属で汚染される可能性があることである [96]。いくつかの研究者は、短時間の採尿で鉛の排泄について十分な情報が得られることを示唆した[97]。例えば、Gulson らは、鉛の同位体組成について、血液と尿のペアには極めて良い相関があることを明らかにし、特に新生児や幼児においては、尿が血液の代替となり得ることを示した[96]。福井らは、尿中鉛は、クレアチニン濃度によって調整されない、集団ベースの血液中鉛測定に代わる良い方法であることを示唆した[98]。本研究では、子どもを対象としたバイオモニタリング研究において最も一般的で好ましい生体試料である尿のスポット採取をPb測定のために選択した。非侵襲的な試料（例えば、血液）は、臨床的な手順は、幼児に実行することが困難であり、親の不安を作成し、少ない参加と潜在的に選択バイアスにつながる可能性があるので、侵略的な試料（例えば、尿）の代わりに収集された[99, 100]。
鉛の濃度が上昇レベル以下であること
本調査の両群の尿中鉛濃度は、上昇値である 5.0 μg/dL 以下であった。尿中鉛濃度の最高値は2.5μg/dLであった。155人の参加者のうち、ほとんどの子供（90.0%）は尿中鉛濃度が1.0μg/dL以下であった（n = 135）。これまで蓄積されたデータ（1990年代初頭以降）は、低濃度レベルで発生する鉛の毒性について十分な証拠を提供している[101]。子どもは鉛への曝露に対してより脆弱であり、神経発達障害に苦しむ可能性が高いので、幼い子どもにおける健康への悪影響の重要性は過小評価できない[102]。以前のコホート研究では、BLLが10.0μg/dL未満の子どものほとんど、またはすべてにおいて有意な逆相関が示され [36、103、104]、他のコホート研究では1.0-2.0μg/dLと低かった[105-107]。利用可能な証拠は、米国およびヨーロッパ諸国における平均BLLが2.0〜4.0μg/dLであることを示唆している[108]。我々の研究は，ROC曲線解析から尿中鉛の0.25μg/dLという有意なカットオフ点を示し，このレベルでは鉛の神経毒性作用の可能性を示している。しかし，特に幼児において神経学的影響を引き起こす最低レベルは，今回の知見から結論づけることはできない。
本研究のすべての子供たちの尿中鉛濃度が低いことは、クアラルンプール都市部での鉛曝露が改善されたことを反映している可能性がある。クアラルンプール都市部で行われた以前の研究では、2000年に5.26μg/dL（BLLs）だった小児のPb濃度が[80]、2007年には3.40μg/dL（BLLs）と減少傾向にあることが示された[109]。今回の調査では、さらにPb濃度は0.42μg/dL（尿中Pb）まで低下している。尿中の鉛濃度は血液中の鉛に比べて一般に最低10倍低いので、これらの研究では異なる生体試料が用いられたが、この比較は有効である[88]。
20年以上にわたってマレーシアの子供たちの鉛濃度が低い理由は、マレーシア政府が1998年初頭からガソリンから鉛を段階的に排除するという行動をとったためであると考えられる[110]。その結果、大気中の鉛濃度は1990年から2004年にかけて大きく減少した[111]。マレーシア政府は、最新の国家自動車政策（NAP）2020 [112]を含む一連の政策を策定し、代替自動車の利用を奨励している。その例として，バッテリー電気自動車（BEV）や公共交通機関（電気バス，モノレール，電気鉄道など）が挙げられる．さらに、マレーシアは2014年から陶磁器製品に含まれる重金属（Pbを含む）の規制を計画していた。しかし，2020年にマレーシアは，検査中の調理器具のPbの最大放出量について，世界貿易機関（WTO）に新しい基準値である0.5mg/Lに通知した[113]。この新しい基準は，調理に使用される包装，器具容器，容器からの浸出液中のPbは2.0mg/Lを超えてはならないとした1985年の食品規制の13番目のスケジュールに取って代わった[114]。
マレーシア国内貿易・協同組合・消費者省（MDTCC）は、14 歳未満の子供を対象とした玩具の安全基準を 強制的に規制している。塗料中の鉛の最大許容移動量は、90.0ppmを超えてはならない[115]。マレーシアは、国内のE-waste分野全般を管理するための現地法の枠組みも導入している。これらの枠組みには、マレーシアで予定されている廃棄物や e-waste 管理に関連する法律や立法に基づく、発生、移動、リサイクル、廃棄が含まれる。これらの法律や立法には、環境品質法（EQA）1974、環境品質（規定施設）（予定廃棄物処理・処分施設）規則1989、環境品質（規定施設）（予定廃棄物処理・処分施設）命令1989、環境品質（予定廃棄物）規則2005、税関（輸入禁止）命令2012、税関（輸出禁止）命令2017が含まれます[116]。
ASD児の尿中鉛濃度の低下
今回の結果は、クアラルンプール都市部の就学前児童において、尿中の鉛が多いことがASDと関連するという初期の仮説を支持するものではなかった。むしろ、ASD児の尿サンプルのPb濃度はTD児より有意に低かった（ASD児0.26μg/dLに対してTD児0.58μg/dL）。年齢や性別などの潜在的な交絡因子を調整した場合（表2）2）、ASD児の尿中鉛濃度がTD児より高いことを示す十分な根拠は得られなかった。
しかし、私たちの一変量結果は、1980年代初頭から2020年までの他のいくつかの研究と一致している。これらの研究では、表7.7に示すように、ASD児の尿中Pb濃度はTD児より低いと報告されている。例えば，Marloweらは，人種や社会階層をマッチさせたTD児（平均6.66±2.49ppm）に比べ，ASD児の毛髪サンプルのPb濃度は有意に低い（平均6.28±2.12ppm）ことを報告している[118]。日本では，安田らがASD児の毛髪試料中の鉛濃度を，年齢・性別をマッチさせたTD児（平均0.89±0.50ppb）と比較して有意に低いことを報告している[119]。トルコでは，YorbikらがASD児の尿サンプル中の鉛濃度が，非対照のTD児（平均4.63μg/gクレアチニン）に比べ，有意に低いことを報告している[122]。サウジアラビアでは，アラブダリらが，年齢・性別をマッチさせたTD児（平均6.79μg/dL）に比べてASD児（平均4.73μg/dL）の血液サンプルのPb濃度が有意に低いと報告している[126]。ジャマイカでは，Rahbarらが，ASD児の血液サンプルの鉛濃度が，年齢と性別をマッチさせたTD児（平均2.73μg/dL）に比べ，有意に低いことを報告した[127]。その5年後、同じ著者（Rahbarら）は、ASD児の血液サンプルのPb濃度が、年齢と性別をマッチさせたTD児（幾何平均2.34μg/dL）に比べ、有意に低いことを報告した[131]。
同様の結果（ASD児のPb濃度が対照群に比べて低下）を示した先行研究のリスト
ASD児の鉛の排泄メカニズムの悪さ
本研究の結果は，ASD児はTD児に比べて重金属（Pbを含む）の排泄能力が低く，解毒能力が低いと考えられるという価値観も支持しており，これまでの証拠[132, 133]からも支持されるものであった。重金属の排泄能力の低下は，より高い体内負担とその後の神経学的障害をもたらすかもしれない［121, 134］。ASD児が重金属（Pbを含む）の排泄を困難にした理由は不明であり，十分に説明されていない。しかし，特異的な抗酸化物質の存在や，排泄の際のCaとPbの競合メカニズムによって，Pbの排泄の悪さを説明できるのではないかと推測される。
環境負荷に反応する酸化ストレスは、基本的に人間のあらゆる疾病に関与している。ASDの病因にも関与していると推定され、ASDにおける抗酸化能の低下と酸化ストレスの増大は、神経構造の損傷と神経機能の低下をもたらすとされている[135, 136]。グルタチオン（GSH）、L-システイン、N-アセチルシステイン（NAC）、タウリン、メラトニンなどの内因性チオールは、重要な抗酸化物質の一例である。これらの抗酸化物質は、金属の利用可能性を減らし、臓器細胞や生体高分子へのダメージを減少させ、解毒を促進することができます。抗酸化物質は、フリーラジカルの消去、ラジカル連鎖反応の中断、鉛を含む重金属との安定した複合体形成など、様々な作用機序で働く[121, 137]。したがって、ASD児の体内の抗酸化物質のレベルは低下しており、児の脳における重金属の隔離を促進し、その後、尿中の重金属の濃度が低くなると考えられる[121]。
鉛に対する必須微量元素の役割
尿中Pbのほか、ある種の必須微量元素の濃度がASD児ではTD児より有意に低かった。尿中Zn（ASD児39.81μg/dLに対してTD児88.88μg/dL）、尿中Fe（ASD児34.69μg/dLに対してTD児58.32μg/dL）であった。また、尿中Mg濃度はASD児の方がTD児より低値であったが、有意差はなかった。しかし、年齢と性別を調整すると、4歳以上の子ども（ASD児102.34μg/dL、TD児140.45μg/dL）、男性（ASD児106.00μg/dL、TD児139.96μg/dL）では尿中Mgの平均値の差は顕著に現れていることが確認された。一方、4歳以下のASD児では、TD児に比べ尿中Caが有意に高いことが示された（ASD児107.95μg/dL vs TD児34.18μg/dL）。
本研究における必須微量元素の一変量所見は、Mg、Zn、Feに関する先行研究と整合的である。例えば、Skalnyらは、ASD児の毛髪中Mg濃度（ASD児17.91μg/g対TD児18.84μg/g）および尿中Mg濃度（ASD児108.59μg/ml対TD児118.51μg/ml）が非対象TD対照より低いことを実証している。しかし，その結果は有意ではなかった[138]。Priyaらは、低機能自閉症（LFA）（平均174.02 ± 20.88 μg/g）、中機能自閉症（MFA）（平均202.21± 24.26 μg/g）、高機能自閉症（HFA）（平均236.31 ± 28.35 μg/g）の子供の毛髪中のMg濃度が対照群（平均454.36 ± 54.52 μg/g）より有意に低かったことを実証している。この知見は、毛髪中のMg濃度レベルの減少に伴ってASDの重症度が上昇することを示唆した[139]。Strambiらは，ASD児の血漿Mg濃度（平均2.27 ± 0.33 mg/100 mL）が，マッチしない健常児（平均2.51 ± 0.14 mg/100 mL）に比べ有意に低いことを示した[70]。システマティックレビューとメタアナリシス研究は、ASD児の毛髪（効果量-0.612、z値=2.68、p=0.007の異常値研究を除去後）と血清（効果量-0.105、z値=5.88、p < 0.001）中のMgレベルが健常対照に比べて著しく低いことを報告している[140]。
Znについては、PriyaらはLFA児の毛髪中のZn濃度（平均130.46±15.65μg/g）が対照群（平均171.68±20.60μg/g）より有意に低いことを示した[139]。Liらは，ASD児の血清中のZn濃度（平均78.70±7.00ng/mL）は，年齢と性別をマッチさせた健常対照群（平均87.70±8.70ng/mL）と比較して有意に低いと報告している[141]。Saghazadehらは、2つの外れ値の研究を除外した後、ASD患者（n = 513）が対照（n = 333）よりも血中Znレベルが低いことを示す-0.361（z値= 2.31, p = 0.021）の有意な効果量を報告した。さらに感度の高い毛髪サンプル分析では、外れ値の研究を除外した後、アジア人のASD患者（n = 236）は、アジア人の患者（n = 306）よりも毛髪中のZnレベルが低い（標準化平均差（SMD） = -1.493, p = 0.002）ことが示されました[140]。
Feについては、LubkowskaらがASD児の毛髪中のFe濃度（平均9.02±4.62μg/g）が年齢を合わせた健常対照者（平均10.05±2.92μg/g）より著しく低いことを実証しています[142]。さらに，Saghazadehらは，外れ値の研究を除外した上で，ASD児の毛髪中のFe濃度が健常児よりも低いことを示す-1.410（z値＝2.38，p＝0.017）の有意な効果量を報告している[140]。
Ca については、他の微量元素（Mg、Zn、Fe）と一変量解析が矛盾している。しかし、最近の研究では、年齢と性別をマッチさせた神経症児（中央値106.71、25-75パーセンタイル103.82-112.3）よりもASD児（中央値109.16、25-75パーセンタイル103.55-113.5）の血清中に高いCa濃度が見出され、同様の結果が報告された[143]。しかし、結果は非有意であった。
尿中微量元素の回帰分析から、尿中ZnはASDの保護因子であると思われた（OR = 0.95, 95% CI 0.91, 0.99, p = 0.008）。尿中Znによる保護効果は、さらに交互作用解析を行ったところ、有意に増加した（OR = 0.89, 95% CI 0.83, 0.95, p = 0.001）。尿中FeはASDに対して保護効果を発揮することがわかった（OR = 0.77, 95% CI 0.69, 0.87, p < 0.001）。しかし、尿中鉄分の保護効果は、さらなる交互作用解析の結果、減少し、有意ではなかった（OR = 0.95, 95% CI 0.73, 1.24, p = 0.698）。これらの知見は、体内の必須微量元素、特に Zn と Fe の存在が、鉛の神経毒性に対抗するために重要であることを意味する。
必須微量元素（Mg、Zn、Feなど）は抗酸化剤として重要な役割を果たし、それによって、これらの元素が体内に存在することで、組織における金属の再分配と蓄積を防ぎ、金属の利用率を下げ、毒性を減らし、細胞膜を安定させ、生体高分子へのダメージを減少させます[137]。これらの元素はまた、必須イオンの置換を減少させ、不溶性の金属-ミネラル複合体を形成し、金属結合タンパク質（MT）を生成することによって、催奇形性の毒性を減少させる[137]。必須微量元素はまた、重金属の消化管吸収を減少させ、競合的吸収メカニズムによってその分布を減少させる[137]。しかし、我々の知見はこの説を支持することができなかった。尿中 Pb と必須微量元素の相関は、尿中 Pb と Ca の相関が非有意に負の非常に弱い相関を示した以外は、有意に正の非常に弱いから中程度の相関係数 (r 値は 0.19 から 0.44) を示した (p > 0.05) 。
ASDのその他の関連因子の評価
ASDのいくつかの関連因子が同定された。これらの要因は、民族性、親の教育、子供の性別、親の喫煙状況であった。我々の発見は、第三次教育を受けた親は、中等教育を受けた親に比べ、ASD児を持つ確率が26倍であることを示した（OR = 26.15, 95% CI 7.10, 96.38, p < 0.001）。この知見は，Eowらによって支持され，第三次教育を受けた母親のASD児を持つオッズは，中等教育以下の母親と比較して3.5倍高かった（OR = 3.47，95% CI 1.00，5.94） [144] 。
民族別では、ASD児群（n=18/63（22.2%））とTD児群（n=4/70（5.4%））で非マレー人の割合が少なかった。しかし、民族性（非マレー人）はASDの有意な危険因子であった（OR =7.52, 95% CI 1.62, 34.85, p = 0.010）。マレー系以外の子どもは、マレー系の子どもと比較してASDを発症する確率が約4.5倍であると報告した研究がある（OR = 4.52, 95% CI 2.10, 6.94）［144］ 。
性別については、ASD児の男女比は5：1であった。この比率は、これまでに報告されている4：1［145］や3：1［146，147］よりも高い。したがって、男性の性別はASDの有意な危険因子であった（OR = 8.52, 95% CI 2.76, 26.28, p < 0.001）。
最後に、元喫煙者である親（父親か母親）は、非喫煙者の親よりもASD児を持つ確率が高いという結果が出た（OR = 25.29, 95% CI 4.03, 158.68, p = 0.001） 。しかし、現役の喫煙者である親ではこの所見は有意ではなく、重金属（鉛を含む）に対する曝露は出生前および出生前の期間に起こる可能性があることを示している。親が禁煙を決意するのは、子どもがASDと診断されたことに影響されるかもしれない。妊娠中の母親がセカンドハンドスモーカー（主に喫煙している夫や配偶者に関係）であっても、ASD児のリスクは依然として高い（OR = 3.53, 95% CI 1.30, 9.56） [148].
推薦の言葉
本研究は、ASDの予防策、特に環境衛生と栄養の観点に焦点を当てた。安全な鉛の濃度は存在しないので、幼児は鉛に曝露されるべきではない。それでも曝露される場合は、曝露量を最小にする必要がある。トップ・ステークホルダー（＝政府）は、関連する法律・法規の施行により予防策を開始し、改善すべき である。現在の規制では、鉛の基準値は頻繁に改訂され、必要に応じて修正されるべきとされている。鉛を含む製品製造（例：塗料、陶磁器、玩具、電気・電子機器）の管理・監視を強化する必要がある。
また、政府、特に保健省が新生児と就学前児童を対象とした初の全国的な鉛スクリーニング・プログラムを開始することを提言する。この方法は、数十年前にアメリカで行われた。このプログラムは、おそらく家族の社会・人口統計的背景をリスクに基づいて評価することにより、高リスクの乳幼児グループを特定することから始めることができるだろう。さらに、国レベルでの小児暴露の有病率や環境関連疾患の負担を特定し、分析することで、関係者がさらなる行動を起こすことができるだろう。MOHはまた、目的（短期または長期の暴露モニタリング）と実験室での分析コストに応じて、バイオモニタリングのためのさまざまな種類の試料を決定することができる。家族レベルでは、両親または養育者は、子供への鉛の曝露を最小限に抑えるために、有害な環境要素の健康への影響について十分な知識を持つべきである。鉛の曝露に関する保護者の知識は、マスメディア、電子社会メディア、ヘルスケアセンター（例：保健所や病院）のいずれかから、様々な健康教育を通じて向上させる必要がある。
栄養面では、保護者が必須微量元素を十分に摂取することをお勧めします。この記事で述べたように、必須微量元素は、十分に摂取することで子どもの体に多くの恩恵をもたらします。MOH, National Coordinating Committee on Food and NutritionによるRecommended Nutrient Intakes (RNI) for Malaysia 2017 [77]によると、1～3歳児の推奨Ca摂取量は1日700.0mg、4～6歳児は1日1000.0mgとされています。Mgについては、1～3歳および4～8歳の子どもの推奨摂取量は、それぞれ1日80.0mgおよび1日130.0mgである。一方、Znは1〜3歳が1日4.2mg、4〜6歳が1日5.2mgと推奨摂取量が定められています。最後に，1-6 歳児の推奨 Fe（生体内利用率 10.0%）摂取量は 1 日 6.0mg であるが，1-6 歳児の推奨 Fe（生体内利用率 15.0%）摂取量は 1 日 4.0mg である。
制限事項
本研究の結果は慎重に解釈されるべきものである。鉛および必須微量元素は尿検体でのみ調査され、これらの元素によって脳内で起こる複雑な病理学的メカニズムを十分に説明できない可能性がある。また、ASD児のPb濃度が比較的一定しないのは、ASDの異質性（スペクトラム）、被験者の多様な地理的位置、あるいは方法論の違いに起因している可能性がある。しかしながら、これらの結果は、ASDにおける鉛および他の重金属の役割の可能性を調査するために、さらなる研究が必要であることを示している。
結論
両グループの尿サンプル中のPb濃度レベルは、CDCの上昇レベル以下であった。また、ASD児のPb濃度レベルはTD児より有意に低いことがわかった。Pb濃度レベルが低いのは、解毒機構が悪く、Pbを体内に多く保持する一方で、尿中へのPbの排泄量が少ないためと考えられる。また、必須微量元素である尿中Mg、Zn、Feの濃度が有意に低いことが、ASD児におけるPbの神経毒性作用を増強している可能性がある。これらの知見は、ASD児の中枢神経系を保護するために必須微量元素が重要であることを示唆している。予防戦略は一貫したものであるべきで、利害関係者や両親の参加を得て、子供たちの鉛への暴露を最小限に抑えるようにすべきである。予防戦略は、就学前児童のASDの発生と進行を抑えるために、最適な栄養を提供することが重要である。
